二硫化钼负载呋喃西林协同抗菌研究

张瑶新马陇豫冯 闪张 审刘超群

河南大学 药学院，河南 开封475004

微生物种类主要包括细菌、真菌、病毒等，而有害细菌的传播和发展更是严重威胁着人类的生命健康和打扰人类的日常生活［1］。抗菌材料是防止细菌的产生和蔓延最有效的方法之一［2］。目前的抗菌材料根据化学物质内部不同分为三种，包括天然、有机、和无机抗菌材料［3］。

二硫化钼（MoS2）是一种常见的过渡金属硫化物（TMD），是辉钼矿的主要成分之一，呈黑色固体粉末，具有金属光泽，属于六方晶系或斜方晶系。MoS2的层状结构类似于“三明治夹心”，具体为一层钼原子层夹在两层硫原子层之间［4］。因其特殊层状结构，具备很多优异的性能，如更好的吸附性能、更大的比表面积，优异的物理化学性质和细胞相容性。除此之外，MoS2的化学性质非常稳定，耐高温，不与大部分的橡胶制品和金属发生化学反应，仅能被浓硫酸、浓硝酸等强氧化剂腐蚀，使MoS2在生物医学领域成为非常有前景的新型材料［5］。以MoS2为代表的一系列过渡金属硫化物在近红外区都具备很强的吸收效果，是非常好的光热试剂，可以将光能转化为热能，利用光能转化的热能产生的高温可以杀灭细菌。这一方法毒副作用较低且具有很好的区域选择性。

呋喃西林（NFC）为一种淡黄色结晶性粉末，无臭，味初淡，略溶于水（1 ∶4 200）。属于硝基呋喃类药物，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌作用，是一种广谱抗菌药［6］。这类药物主要通过干扰细菌体内氧化酶系统和糖代谢过程，导致细菌新陈代谢紊乱而死亡，从而达到杀菌的效果［7］。还可以预防和治疗肠胃炎、球虫病等［8］。

根据文献记载，光热抗菌由于长时间暴露在高功率的近红外激光下，可能会导致皮肤的损伤，产生耐药性等问题，限制了这种材料在光热治疗抗菌的应用。因此我们在探究二硫化钼光热抗菌的同时，在二硫化钼表面负载一种药物即呋喃西林，探究这种纳米载药复合物的协同光热抗菌效果。

1 MoS2／NFC 纳米载药复合物的合成

1.1 实验试剂

钼酸钠（上海阿拉丁生化科技有限公司）；PEG⁃400（天津市石英厂坝县化工分厂）；硫代乙酰胺（上海阿拉丁生化科技有限公司）；呋喃西林原料药（上海阿拉丁生化科技有限公司，批号20140601）；呋喃西林对照品（中国药品生物制品检定所提供）；磷酸二氢钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；营养琼脂（北京陆桥技术有限有限责任公司）。

1.2 实验仪器

分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司）；激光粒度及Zeta 电位分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）；高速离心机（湘仪实验室仪器开发有限公司）；紫外－可见分光光度计（优尼柯（上海）仪器有限公司）；扫描电子显微镜（日本岛津公司）；808 nm 红外半导体激光器（宁波远明激光有限公司）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海市申安医疗器械厂）；双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；恒温恒湿培养箱（北京中心伟业有限公司）。

1.3 MoS2 的合成

取30 mg 钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和60 mg 硫代乙酰胺（C2H5NS）于烧杯中，加20 mL PEG⁃400 水溶液（50%，v／v）（即10 mL 的水，10 mL 的PEG⁃400溶液），用玻璃棒搅拌均匀至溶解。在200 ℃下转移到100 mL 聚苯内衬不锈钢高压釜中24 h。结束后冷却至室温，打开反应釜，转移至离心管中，加入去离子水，于超声波清洗仪器中摇晃超声至均匀。放入8 000 r／min 的高速离心机中离心21 min，弃去上层清液，同样方法反复洗涤3 次。放入50 ℃的电热鼓风干燥箱中干燥6～10 h，即得到黑色的MoS2材料标记为MoS2，在室温下储存。

1.4 MoS2／NFC 纳米载药复合物的合成

取2.864 g Na2HPO4·12H2O 和14.352 g NaH2PO4·2H2O，用900 mL 去离子水将其溶解，用pH 计调节pH 至5.3，再加入去离子水定容至1 000 mL，即得到磷酸缓冲溶液PB（pH 5.3），放置，备用。

取5 mg 呋喃西林粉末于离心管中，加1 mL PB（pH 5.3）溶液，超声至完全溶解。取上文制得的3 mg MoS2于离心管中，超声，混合均匀。用封口膜封住离心管口，放入摇床上摇24 h，至混合均匀，离心机8 000 r／min 离心21 min，取上清液于另一个EP管中标记为上清液1，再加入PB（pH 5.3）溶液洗，离心，取上清液，记录体积，标记为上清液2，剩下沉淀部分放入电热鼓风干燥箱中干燥6～10 h，即得到二硫化钼／呋喃西林纳米载药复合物，标记为MoS2／NFC。

2 测试与表征

2.1 扫描电子显微镜（SEM）观察

选用上文制备好的MoS2用扫描电子显微镜来观察MoS2的形貌表征。

2.2 电位和粒径测定

选用激光粒度及Zeta 电位分析仪测量MoS2的电位和粒径大小。样品配制与测定：用钥匙取适量干燥的MoS2于EP 管中，加入蒸馏水，置于超声仪中使其分散均匀，放入激光粒度及Zeta 电位分析仪中，即可测量MoS2的电位和粒径大小。

2.3 MoS2 的分散性试验

取适量的二硫化钼配制一定浓度的溶液，静置，并在7 d 后观察溶液的变化，与之前做对比，观察溶液的分散性变化。

2.4 紫外光谱图测定

配制适当浓度的NFC、MoS2观察紫外特征吸收峰处吸光度值，同时配制适宜浓度的MoS2／NFC的浓度来观察紫外特征吸收峰处吸光度值的变化。

2.5 紫外可见全波长测定呋喃西林的吸附率

为了测定MoS2／NFC 材料表面的所含NFC 的量，首先对NFC 对照品溶液进行紫外全波长扫描。结果表明，NFC 对照品溶液在375 nm 处有最大吸收峰。配制不同浓度的呋喃西林溶液，分别为0.002 mg／mL、0.005 mg／mL、0.008 mg／mL、0.011 mg／mL、0.014 mg／mL。然后，通过对不同浓度的NFC 对照品溶液进行紫外全波长扫描即可得到不同浓度的NFC 对照品溶液在200～700 nm 的紫外全波长吸收数据。

以不同浓度的NFC 对照品溶液为横坐标，测得不同浓度的NFC 对照品溶液在375 nm 处的紫外特征吸收峰处吸光度值为纵坐标，制作标准曲线图，并得出标准曲线方程式。根据方程式，得到不同浓度NFC 对照品溶液的吸光度值。

最后通过测定NFC 溶液和MoS2溶液反应过后的复合材料，离心得到的上清液在375 nm 处的吸光度值，差量计算材料样品表面的NFC 的含量，计算吸附率。

2.6 测试MoS2 的光热性能

1）测试同一功率不同浓度条件下MoS2和MoS2／NFC 的光热性能变化。配制不同浓度的MoS2溶液和MoS2／NFC。分别为0.25 mg／mL、0.35 mg／mL、0.4 mg／mL。采用808 nm 激光在1.5 W／cm2功率下照射不同浓度的MoS2溶液10 min，观察10 min内温度的变化，每隔2 min 记录下MoS2和MoS2／NFC 溶液的温度变化，作出曲线图进行比较。

2）测试同一浓度不同功率条件下的MoS2和MoS2／NFC 光热性能变化。用808 nm 激光功率强度分别为0.8 W／cm2、1.0 W／cm2、1.5 W／cm2，照射固定浓度为0.45 mg／mL 的MoS2和MoS2／NFC 溶液，观察10 min 内温度的变化，每隔2 min 记录下MoS2和MoS2／NFC 溶液的温度变化，作出曲线图进行比较。

2.7 材料的抗菌活性测试

选用三种菌来进行材料的抗菌性能测试，分别为以革兰氏阳性菌的S.aureus、革兰氏阴性菌的E.coli、真菌类的C.albicans为三类菌代表测试复合材料对三种不同菌的抗菌活性。取3 个灭过菌的EP管配制MoS2、NFC、MoS2／NFC 各自为5 mg／mL 的母液，然后编号1～5 为MoS2组，6～10 为NFC 组，10～15 为MoS2／NFC 组。每组加入材料、PB（pH 5.3）、菌液，稀释成浓度分别为0.25 mg／mL、0.35 mg／mL、0.45 mg／mL、0.5 mg／mL、0.6 mg／mL 的溶液，取100 μL 于固体培养基上，涂木棒涂抹均匀后，置37 ℃的恒温培养箱中，培养12～18 h。观察材料的抗菌效果，拍照记录。实验重复3 次，观察抗菌图，通过对比菌的数量，观察复合材料的抗菌性能变化。

3 结果与讨论

3.1 扫描电子显微镜

MoS2的尺寸大小为400 nm，MoS2的形貌为规整的纳米花状球形结构，且MoS2纳米花表面褶皱明显，颗粒大小均匀，且颗粒间隙比较明显。见图1。

图1 MoS2 的扫描电子显微镜图

3.2 电位和粒径

MoS2的电位值为－34.3 mV，表明二硫化钼的表面带负电荷，见图2。MoS2平均粒径大小为400 nm左右，与上文扫描电子显微镜测得的结果相符合，见图3。

图2 MoS2 的电位图

图3 MoS2 的粒径

3.3 MoS2 的分散性试验分析

溶液的分散性没有发生变化，表明溶液稳定性良好。见图4。

图4 MoS2 溶液（a），静置7 d 后的MoS2 溶液（b）

3.4 紫外分光光度计测定结果分析

NFC 在450 nm 处具有吸收边缘，MoS2在200～900 nm 内都有较强的吸收，且MoS2／NFC 与NFC 相比在500 nm 以后有较大提高，表明呋喃西林的成功负载。见图5。

图5 MoS2／NFC 的紫外分光光度计测定结果变化

3.5 紫外可见全波长测定呋喃西林的吸附率

由NFC 的紫外可见全波长扫描图可知，NFC 在375 nm 处有最大吸收峰，见图6。NFC 的标准曲线图，将MoS2／NFC 溶液离心，取上清液并记录体积，测量上清液的吸光度，代入以上标准曲线方程，即可知道上清液的浓度，根据已知数据可得计算，呋喃西林的吸附率为15%，见图7。

图6 不同浓度的NFC 的紫外可见全波长扫描图

图7 NFC 的标准曲线方程

3.6 MoS2 的光热性能分析

1）测试同一功率条件下，不同MoS2和MoS2／NFC 浓度的光热性能变化。见图8、图9。

2）测试同一浓度不同功率条件下的MoS2和MoS2／NFC 光热性能变化。见图10、图11。

由图8、图9 可以看出，在同一功率下（1.5 W／cm2）的照射下，随着MoS2和MoS2／NFC 溶液浓度的增大和照射时间的增加，材料溶液的温度不断上升。从图10、图11 可以看出，照射同一浓度（0.45 mg／mL）的MoS2和MoS2／NFC 溶液，随着激光功率的增大和时间的增加，材料溶液的温度逐渐升高，并在照射持续10 min 时，逐渐平缓，可得出MoS2有较好的光能转化为热能的性质，有足够杀菌的能力。

由实验结果可得，通过对比图8、图9 MoS2和MoS2／NFC 在同一功率不同浓度条件下的溶液温度变化图与图10、图11 MoS2和MoS2／NFC 在同一浓度不同功率下溶液温度变化图，表明二者的温度变化差异并不明显。结果显示，MoS2的光热性能不会因表面负载抗生素呋喃西林（NFC）而受到影响。

图8 同一功率不同浓度下MoS2 溶液的温度变化图

图9 同一功率不同浓度下MoS2／NFC 溶液的温度变化图

图10 同一浓度不同功率下MoS2 溶液的温度变化

图11 同一浓度不同功率下MoS2／NFC 溶液的温度变化

3.7 材料的抗菌结果分析

材料MoS2在未光照条件下，E.coli的数量与空白菌液的数量相当，几乎长满了菌，而光照条件下剩下大约一半的菌，NFC 在光照或未光照条件下都杀了约一半的菌，MoS2／NFC 在未光照条件下，大约剩下一半的菌，光照条件下，抑菌率在99%以上，此时MoS2／NFC的最小抑菌浓度为0.5 mg／mL。见图12。

图12 材料与E.coli 接触后的抗菌效果

材料MoS2在未光照条件下，S.aureus的数量与空白菌液的数量相当，几乎长满了菌，而光照条件下剩下大约一半的菌，NFC 在光照或未光照条件下都杀了约一半的菌，MoS2／NFC 在未光照条件下，大约剩下一半的菌，光照条件下，抑菌率在99%以上，此时MoS2／NFC 的最小抑菌浓度为0.4 mg／mL。见图13。

图13 材料与S.aureus 接触后的抗菌效果

材料MoS2在未光照条件下，C.albicans的数量与空白菌液的数量相当，几乎长满了菌，而光照条件下剩下大约一半的菌，NFC 在光照或未光照条件下都杀了约一半的菌，MoS2／NFC 在未光照条件下，大约剩下一半的菌，光照条件下，抑菌率在99%以上，此时MoS2／NFC 的最小抑菌浓度为0.35 mg／mL。见图14。

图14 材料与C.albicans 接触后的抗菌效果

实验结果表明，MoS2只有在808 nm 近红外激光照射下，才有较强的杀灭细菌的能力。光照对呋喃西林的抗菌效果无影响，复合材料有更优异的协同抗菌作用，可以在较小浓度时的杀菌率达到99%以上。

4 讨论

选用以钼酸钠为钼源和硫代乙酰胺为硫源用低成本的水热法制备出材料MoS2纳米花，并利用MoS2纳米花表面的孔状结构，有较大的吸附能力，可以成功将呋喃西林负载在MoS2上，制备出复合材料MoS2／NFC，这一合成方法生产成本低、安全环保、简便快速。

通过对革兰氏阴性菌－大肠杆菌（E.coil）、革兰氏阳性菌－金黄色葡萄球菌（S.aureus）、真菌－白色念珠菌（C.albicans）的抗菌能力测试，复合材料MoS2／NFC 的抗菌能力明显优于单一材料MoS2和NFC，具有优异的协同抗菌作用，可使抗菌材料在较少的用量下具有较高的杀菌率。

因此，该抗菌材料在生物医药领域有了更广阔的应用价值和发展前景。但现在的抗菌材料产业还不够发达，需要我们更深入地研究和学习目前国际抗菌材料发展的各种经验，争取做到抗菌材料的进一步发展。