基于碳点/银纳米颗粒荧光探针检测牛奶中的H2O2

彭东升，王应仙，王 瑞，张恒琦，孙文兵

(1.污染物分析与资源化技术湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002；2.湖北师范大学 化学化工学院，湖北 黄石 435002)

0 引言

牛奶和奶类商品是全球消费量最高的食品之一。在很长的历史中，乳制品行业广泛使用过氧化氢(H2O2)和防腐剂来防止变质或延长乳制品的使用寿命[1]。但是过量的H2O2可以给牛奶的营养价值带来有害影响。例如，它可以诱发叶酸的降解，而叶酸是人体必需的维生素[2]。此外高水平摄入H2O2会引起严重的胃肠道问题，所以寻找牛奶中过氧化氢的检测方法是很有必要的。

荧光碳点(CDs)是尺寸小于10 nm的碳纳米颗粒，因其高荧光量子产率，出色的水分散性而受到越来越多的关注。碳点可以由多种无机、有机或生物材料或食物及其残渣合成，这些原料都是十分价廉易得的。近年来，一些碳基荧光探针被用于生物和化学领域传感，并取得了很大的进展。

本文以柠檬酸，硼酸和尿素为原料，使用一步水热法合成了氮、硼掺杂碳点N,B-CDs，然后在该碳点溶液中加入AgNPs构建了一种检测H2O2的新型荧光探针体系。由于内滤效应，AgNPs对碳点的荧光有猝灭作用；但加入H2O2之后，碳点的荧光得以恢复。本探针体系不仅易于制备，而且对牛奶中H2O2的检测具有较高的选择性、灵敏性和可靠性，是一种有良好应用前景的传感平台。

1 实验部分

1.1 主要试剂

过氧化氢、硝酸银、硼氢化钠、柠檬酸、硼酸、尿素、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠；七水硫酸镁、二水氯化钙、硝酸铅、氯化钾、氯化钠、七水硫酸锌、六水氯化铁和柠檬酸钠(均为分析纯，购自国药试剂有限公司)；透析袋(MWCO=1000)；超纯水(自制)。纯牛奶购于当地超市。

1.2 仪器

荧光光谱仪(F-4700型，日本Hitachi公司)；紫外可见分光光度计(UH4150型，日本Hitachi公司)；红外光谱仪(Nicolet 5700型，美国热电尼高力公司)；场发射透射电镜(FEI Tecnai G2 F20型，美国FEI公司)。

1.3 N,B-CDs和AgNPs的合成方法

CDs的合成参考文献[3]，并稍作修改：1.00g柠檬酸，0.70g尿素和0.50g硼酸混合并用50ml的超纯水溶解定容后加入反应釜中，然后在马弗炉中180℃下加热6h.待溶液降低至室温后用离心机10 000r/min离心15min，随后将清液用0.22μm微孔滤膜除去杂质，最后转移到透析袋中透析36h得到纯化碳点溶液。4℃保存备用。

AgNPs的合成参考文献[4]，并稍作修改：将6ml 10mM硼氢化钠滴加到100ml 0.5mM的硝酸银和0.5mM柠檬酸钠中，然后在室温下搅拌30min，得到深黄色AgNPs溶液。4℃保存备用。

1.4 反应时间的优化

在狭缝宽度都为10nm，电压为450V，激发波长为340nm，检测范围为370～600nm.固定N,B-CDs和AgNPs的浓度为0.5mg·L-1和200μmol·L-1，添加25 μmol·L-1H2O2，37℃下每隔2min记录荧光光谱。

1.5 pH对反应体系的影响

N,B-CDs和AgNPs的浓度为0.5mg·L-1和200μmol·L-1，添加25μmol·L-1H2O2用磷酸盐缓冲液(PBS，0.2mmol·L-1，pH 7.0)定容至5ml，37℃下避光反应30min.测定荧光光谱，扫描范围为370～600nm.

1.6 H2O2的检测

将100μL N,B-CDs(5mg·L-1)，1 000 μL AgNPs(1mmol·L-1)和100μL 上述PBS缓冲液与不同浓度的100μL H2O2混合定容至5ml.在室温下孵育30分钟，然后340nm的激发波长和430nm的发射波长下进行荧光测量。

1.7 探针体系检测的选择性

为评价该方法对于H2O2检测的选择性，选择了H2O2和10种金属离子(浓度均为50μmol·L-1)，通过F/F0的数值来比较。按照1.6节所述方法进行。

1.8 牛奶样品中H2O2的检测

牛奶前处理步骤参考文献[5]，并稍加修改。将20mL 1mol·L-1H2SO4与80mL牛奶混合，离心(20min，8 000r/min)，收集上清液用1mol·L-1NaOH调整pH到7.0，得到牛奶标准溶液。在稀释的牛奶样品中掺入不同浓度的H2O2，然后进行荧光测量。

2 结果与讨论

2.1 N,B-CDs的表征

FT-IR可用于表征碳点表面的官能团结构。如图1a所示：在3 430 cm-1和3 202cm-1处是O-H/N-H伸缩振动吸收峰；1 670 cm-1,1 400cm-1和1 583 cm-1处的三个峰分别归属于C=O，B-O和C=C伸缩振动。1 166cm-1，1 085cm-1处的吸收峰分别归属于B-OH,C-O-C的弯曲振动。红外光谱证实了前体通过水热碳化反应形成了含N和B掺杂的碳点。图1b为碳点的高分辨TEM图。可见碳点呈球形，直径范围为2.0～4.5nm，均值为2.3nm(图1b)，分布较窄；在水溶液中分散良好。

图1c为碳点水溶液的紫外-可见光吸收光谱。230nm和330nm处存在特征吸收峰，前者是由碳点的共轭C=C键中C原子sp2杂化轨道上电子的π-π*跃迁引起的，后者来源于C-O和C=O的n-π*的跃迁[6]。图1d为碳点的荧光发射光谱图。可发现激发波长从310nm增加到400nm，碳点的发射波长并没有随着激发波长的增加而发生明显的位移，这可能是碳点粒径均一所致；在340nm处激发下，在415nm处获得最大发射强度。

2.2 荧光检测机制

在AgNPs存在下，碳点的荧光被猝灭。为了进一步阐明荧光猝灭机制，对碳点的荧光和AgNPs的紫外吸收光谱进行了测量。如图2a所示，AgNPs在325～475 nm之间显示出较宽的吸收峰，最大吸收波长为400nm.碳点激发和发射光谱分别在300～400nm和400～525nm范围内。当激发波长340nm时，在最大发射波长为420nm.还观察到AgNPs的吸收峰与CDs的激发和发射峰之间有明显的重叠，这表明AgNPs加入所导致的荧光猝灭可能是由于内滤效应(IFE)或荧光共振能量(FRET)转移引起的。但IFE不能缩短碳点的荧光寿命，且辐射能量转移不受距离的限制；FRET中的辐射能量转移是由振动碰撞引起的，因此有10nm的距离限制。为探究荧光猝灭机制，进一步测量了碳点的荧光寿命(图2b)。AgNPs加入前后碳点的平均荧光寿命分别为10.85ns和10.84ns，即AgNPs的加入对碳点荧光寿命几乎没有影响，这证实了碳点的荧光猝灭是由AgNPs的IFE所致。进一步检测紫外吸收，结果如图2c所示。从中可以看出存在和不存在碳点时AgNPs的吸收峰保持不变，这意味着没有新物质形成，从而进一步证实碳点的荧光猝灭是由于AgNPs的IFE而非FRET.从图2c中也可以看出在H2O2加入以后AgNPs的紫外吸收特征峰明显下降，这说明H2O2成功刻蚀了AgNPs.

随着AgNPs的IFE减弱，体系的荧光强度得以部分恢复。不同浓度的AgNPs刻蚀程度不同，体系荧光强度的恢复也不一样(图3a)。实验中还发现在一定范围内，AgNPs浓度与体系荧光强度存在线性关系(图3a)。在刻蚀AgNPs较充分的前提下，建立起刻蚀剂H2O2浓度与体系荧光强度的定量关系，也就能实现对H2O2的定量检测。

2.3 检测条件的优化

2.3.1 AgNPs浓度的选择 由图3a可知，AgNPs浓度越大，碳点的荧光猝灭程度越大，但在AgNPs浓度达到200μM后，继续增大其浓度，发现碳点的荧光猝灭程度变化不明显了，因此AgNPs适宜浓度确定为200μM.

2.3.2 检测时间的影响 有研究表明，反应时间是影响过氧化氢刻蚀金属纳米颗粒的重要因素[7]。如图3b所示，加入H2O2后，随着反应时间的延长，荧光强度逐渐恢复，并且在30min后荧光强度趋于稳定。因此选择30min作为最佳检测时间。

2.3.3 pH的影响 pH对体系荧光强度的影响也进行了研究。从图3c可以看到，在pH=7.0时，碳点荧光恢复达到最大值。在pH大于7或小于7条件下，碳点荧光强度都无法恢复到最大值，这是可能因为pH较大或者较小会导致银纳米粒子表面电荷变化，从而降低了H2O2的刻蚀效果[8]，故反应体系的最佳pH值定为7.0.

2.3.4 过氧化氢的检测 在优化条件下定量检测H2O2.碳点的荧光强度随H2O2浓度的增加而逐渐增加(图4a)。用实验获得的荧光强度比值与对应的H2O2浓度数据绘图4b，并进行线性拟合，发现在0～60μM的浓度范围内，F/F0与H2O2浓度有良好的线性关系(R2=0.994)。根据标准偏差规则的三倍估算得出(3δ/S)检测限为0.35μM.

2.4 选择性

为评价N,B-CDs/AgNPs探针体系检测H2O2时的选择性，在碳点溶液中分别加入H2O2和 10种不同物质(浓度均为50μmol·L-1)，测荧光强度并通过荧光强度比值F/F0来比较判断。如图5所示，添加10种物质后，溶液F/F0没有明显变化，这表明N,B-CDs/AgNPs探针体系对检测H2O2具有较高选择性。

图5 加入不同物质后体系的荧光强度比值F/F0

2.5 实际样品的检测

使用该方法对某市售牛奶样品进行检测，未发现H2O2.为了考证本文所构建的H2O2检测方法的实用性，将不同浓度的H2O2掺入牛奶样品中，用于模拟真实样品，检测结果列于表1.由该表可知本检测方法对H2O2的回收率为95.5%～111.4%，相对标准偏差(RSD)≤0.5%，具有较高的准确度和精密度。可见N,B-CDs/AgNPs探针体系为检测牛奶样品中的过氧化氢提供了一种新方法。

表1 牛奶样品中过氧化氢的加标回收(n=3)

2.6 不同检测体系的比较

牛奶和奶类商品中H2O2的检测一直备受人们的重视。作为比较，表2列出了几种探针体系对H2O2的检测结果。从表中发现对于H2O2的检测，虽然N,B-CDs/AgNPs探针体系线性范围较窄，但具有更低的检测限，即更高的灵敏度。

表2 不同检测方法的比较

3 结论

本文以柠檬酸、尿素和硼酸为原料，采用水热法成功合成了N,B-CDs；以硼氢化钠、硝酸银和柠檬酸钠为原料通过化学反应制备了AgNPs，将两者混合得到了荧光探针体系N,B-CDs/AgNPs.用该荧光探针体系检测牛奶样品中的过氧化氢，建立了分析牛奶等蛋白质样品中过氧化氢的新方法，该方法操作简单，选择性较好、灵敏度高。