自然衰老小鼠肝脏与血清的非靶向代谢组学特征

柳江枫，杨晔宏，武 乐，杨俊涛

1中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 1000052南开大学统计与数据科学学院，天津 300071

衰老是一种复杂的生物学过程，伴随生物体功能的时间相关性下降[1- 2]。既往研究显示衰老常伴随代谢功能紊乱[3]。已有一些干预方法被试用于延缓衰老，如雷帕霉素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)前体物质、衰老细胞清除剂、二甲双胍、运动或能量限制[4]，然而，延缓衰老的方法至今仍然在探索中。既往衰老研究模型大多由基因编辑或药物诱导产生[5]，人们对衰老过程的认识仍需完善，强化自然衰老过程的基础数据的研究十分必要。肝脏是人类与小鼠最大的代谢器官，肝脏的血窦结构使肝实质细胞能够与血液较为充分地进行物质交换，而血液通过全身循环，可进行不同组织间的物质传递。本研究希望对生理状态下不同年龄小鼠的肝脏与血清做代谢组学检测，从整体视角了解衰老相关的代谢功能改变情况。液相色谱-串联质谱技术为大规模生物代谢物鉴定提供了技术支撑。为认识伴随自然衰老发生的代谢改变状况，本研究应用液相色谱-质谱技术对自然衰老小鼠的肝脏与血清做非靶向代谢组学分析，以便为衰老相关基础研究和干预途径选择提供支撑数据集。

材料和方法

实验动物本研究的实验动物是野生型雄性C57BL/6J小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司引进。10只2月龄小鼠划分为年轻组，10只18月龄小鼠划分为年老组。小鼠生长过程中自由进食水，8月龄以后按1只/笼放置小鼠并继续喂养至18月龄。

样本前处理用三溴乙醇麻醉小鼠，眶静脉放血实施安乐死。血液收集在1.5 ml EP管中，常温放置30 min，5000 转/min(转子半径=7.5 cm)离心15 min，将上清转移至新的EP管，-80 ℃保存至样本提取。分离小鼠肝脏，将组织分装，在-80 ℃保存至样本提取。

代谢组学样本前处理、液相色谱-质谱分析、峰提取和化合物鉴定由中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉中心朱正江研究员课题组完成，主要参考课题组的前期经验[6]。每只小鼠取20 mg肝脏组织(加200 μl水制成悬浊液)和100 μl血清进行检测。添加4倍于样本体积的甲醇/乙腈(体积比1∶1)充分混匀，4 ℃水浴超声10 min，-20 ℃继续孵育1 h。随后4 ℃、13 000 转/min(转子半径=7.5 cm)离心15 min，取上清做真空冷冻干燥。用100 μl乙腈/水(体积比1∶1)重悬样本，充分混匀后4 ℃、13 000 转/min(转子半径=7.5 cm)离心15 min，-80 ℃保存至质谱检测。

液相色谱-质谱联用分析用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(1.7 μm粒径，内径2.1 mm，100 mm长)做液相色谱分析。流动相A是含25 mmol/L醋酸铵、25 mmol/L氢氧化铵的水溶液(pH 9.6)，流动相B是乙腈。液相梯度设置为：95% B(0.0～1.0 min)、95% B至65% B(1.0～14.0 min)、65% B至40% B(14.0～16.0 min)、40% B(16.0～18.0 min)、40% B至95% B(18.0～18.1 min)、95% B(18.1～23.0 min)，流速稳定在300 nl/min，样本注入量为2 μl。应用TripleTOF 6600(Sciex)做正离子模式和负离子模式下的串联质谱分析，数据采集模式设为信息依赖性分析，软件Analyst TF 1.7(Sciex)选择一级扫描强度最高的12个母离子进行二级碎裂。

数据处理与生物信息分析使用朱正江研究员实验室开发的内部程序分析质谱仪生成的原始.wiff格式文件，做峰提取和化合物定量。用总离子流对数据做归一化，并填补缺失值。对年轻与年老组间化合物做双样本t检验，用年老组化合物均值比年轻组化合物均值计算变化倍数(fold change，FC)。整理后的数据用R做主成分分析和火山图展示。用SIMCA14软件(v14.1，Sartorius Stedim Data Analytics AB)做正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，并获取OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(variable importance in the project，VIP)。双样本t检验P<0.05且VIP>1的化合物视为有差异；FC>1的化合物视为衰老中上调，FC<1的化合物视为衰老中下调。将正离子模式和负离子模式鉴定到的化合物根据二级谱图匹配度做去冗余整合，差异表达化合物上传至MetaboAnalyst[7]做通路分析。

结 果

肝脏代谢组学特征经过数据过滤，小鼠肝脏在质谱负离子模式和正离子模式下分别鉴定到242和399个代谢物。主成分分析显示，质控样本在正负离子两种模式下均高度聚合，提示质谱仪运行稳定，样本鉴定结果高度可信。而小鼠肝脏代谢组鉴定结果显示样本间的离散度较高，年轻与年老肝脏代谢物整体区分度较小(图1A、1B)。用火山图呈现定性、定量化合物的双样本t检验P值及变化倍数，结果显示负离子模式鉴定到的肝脏化合物在年老组有整体下调偏向(图1C)，而正离子模式鉴定到的化合物改变均衡(图1D)。

PCA：主成分分析；FC：变化倍数；PC1：第一主成分；PC2：第二主成分；QC：质量控制；Neg：负离子模式；Pos：正离子模式

用SIMCA14软件进行OPLS-DA建模分析评估年轻与年老小鼠肝脏代谢物的组间差异，模型质量用7折交叉验证检验。初始OPLS-DA模型得分散点图显示年轻与年老小鼠肝脏代谢组在正负离子鉴定模式下均有组间差异(图2A、2B)。对模型进行200次置换检验，记录每次检验的R2Y(评估分类变量Y的可解释性)值和Q2(评估模型的可预测性)值，与初始分类模型比较，置换检验结果显示初始OPLS-DA模型的Q2值远高于各置换检验结果，R2Y值略高于各次置换检验(图2C、2D)。提示初始OPLS-DA模型不存在过拟合，可以对年轻与年老小鼠肝脏代谢组做有效组间区分，但组间差异较小。将正负离子模式鉴定到的化合物做去冗余整合及差异筛选，将在衰老中上调与下调的肝脏代谢物分别上传至MetaboAnalyst做京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，上调代谢物与核黄素代谢、淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、磷酸戊糖途径、牛磺酸与次牛磺酸代谢以及花生四烯酸代谢等途径关系较为密切(图2E)。下调代谢物与嘧啶代谢、嘌呤代谢、烟酰胺代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢和柠檬酸循环等途径关系较密切(图2F)。

血清代谢组学特征经过数据过滤，负离子模式与正离子模式在小鼠血清中分别鉴定到265和230个代谢物。主成分分析结果显示，质控样本高度聚集，提示质谱仪运转稳定，鉴定结果可靠；正负离子模式下，年轻与年老小鼠的血清代谢物整体区分较为明显(图3A、3B)。计算各代谢物的双样本t检验P值和变化倍数并用火山图呈现，显示正负离子模式下鉴定到的血清代谢物在小鼠衰老时均有整体下调趋势(图3C、3D)。

用SIMCA14软件进行OPLS-DA建模，进一步评估年轻与年老小鼠血清代谢组学的差异状况，初始模型的得分图散点图显示正负离子模式下年轻与年老小鼠血清代谢组均存在组间差异(图4A、4B)。对OPLS-DA模型做200次置换检验，结果显示，原始模型的R2Y和Q2值高于置换检验，原始模型有效，不存在过拟合；负离子模式鉴定的血清代谢物对年轻与年老的区分能力较强(图4C)，正离子模式鉴定的代谢物对两组的区分能力较弱(图4D)。将正负离子模式鉴定的化合物做去冗余整合并筛选差异代谢物。KEGG通路分析显示，衰老时血清中含量上调的代谢物与甘油磷脂代谢、一碳单位池、嘌呤代谢、嘧啶代谢和色氨酸代谢相关性较强，衰老下调的代谢物与氨糖和核糖代谢、氨酰-tRNA合成、精氨酸代谢、嘧啶代谢、甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢等途径相关(图4E、4F)。

肝脏与血清代谢物比较做韦恩图比较肝脏与血清代谢组学鉴定代谢物的异同，显示肝脏与血清共同鉴定到247种代谢物(图5A)，其中衰老相关的共有差异代谢物28个(图5B)。KEGG通路分析显示，肝脏与血清的共同差异代谢物主要与嘧啶代谢和甘油磷脂代谢等途径相关(图5C)。

讨 论

本研究首次共同分析以液相色谱-质谱技术为基础鉴定的衰老小鼠肝脏与血清代谢组状况，肝脏代谢组及血清代谢组在年轻与年老小鼠中的整体区分不明显。血清代谢组的数据特征对年轻、年老小鼠的区别能力强于肝脏代谢组，但血清代谢物的功能更明显与核酸代谢途径相关。肝脏伴随衰老而上调和下调的代谢物功能区分更明显。本研究显示烟酰胺代谢途径伴随衰老在肝脏中下调。烟酰胺是NAD+的前体物质之一，既往研究显示生物体衰老时NAD+含量降低[3]，而补充NAD+或NAD+前体物质，如烟酰胺单核苷酸和烟酰胺核糖可以延长健康寿命和整体寿命[8- 9]。早期研究显示谷胱甘肽含量伴随衰老有所降低[10]，本研究也显示谷胱甘肽代谢途径的衰老相关性下调，谷胱甘肽缺失易导致细胞抗氧化能力下降从而增加氧化损伤风险[11]。而上调的花生四烯酸也提示衰老肝脏存在炎症状态。广泛的通路覆盖提示代谢组学研究复杂生理过程具有优势。

肝脏与血清代谢组共同凸显出核酸相关代谢通路在衰老过程中的下调趋势。核酸代谢伴随衰老下调曾在线虫中观察到[12]。补充嘧啶和嘌呤的代谢中间产物，如尿苷、胞苷和次黄嘌呤可以延长线虫寿命[13]。核酸代谢受损与突变增加、基因组不稳定和肿瘤发生相关。细胞内三磷酸脱氧核糖核苷改变可能损害DNA合成和DNA复制，导致细胞周期失调和双链DNA断裂[14- 16]。肝脏是核酸合成代谢的主要器官，肝脏核酸代谢下调引起的相关化合物减少能影响全身核酸合成或代谢的原料摄取，进而造成细胞周期的广泛减缓，加剧细胞衰老状态(一种永久的细胞增殖停滞状态[17])。

本研究也发现了一些需要继续研究解决的科学问题。以质谱技术为基础做代谢物鉴定以谱图匹配为基本原理，依赖高质量谱图库和稳定的谱图生成过程。本研究虽然鉴定到数目可观的代谢物，但因技术原理限制导致的谱图库规模限制，仍有大量代谢物不能被成功识别。本研究应用的液相色谱分离系统有利于鉴定极性化合物，但可能相应降低对非极性化合物和脂质的鉴定。本研究在肝脏和血清中发现了多种与衰老相关的通路，但多数通路有大量分子无法被鉴定。也提示现阶段有必要将代谢组学与其他生物组学，如转录组学和蛋白质组学，进行联动分析以全面认识衰老过程。衰老是一种复杂的生物学过程，笔者希望以客观呈现结果方式全面展示小鼠的肝脏和血清中代谢物伴随衰老发生的变化，为复杂生物学功能、机制研究或寻找延缓衰老方案提供基础支撑数据集。

OPLS-DA：正交偏最小二乘法-判别分析；KEGG：京都基因与基因组百科全书

A.负离子模式鉴定到的小鼠血清化合物PCA；B.正离子模式鉴定到的小鼠血清化合物PCA；C.负离子模式鉴定到的小鼠血清化合物火山图，呈现每个化合物的FC和双样本t检验P值(红色：P<0.05的化合物；绿色：P>0.05的化合物)；D.正离子模式鉴定到的小鼠血清化合物火山图，呈现每个化合物的FC和双样本t检验P值(红色：P<0.05的化合物；绿色：P>0.05的化合物)

综上，本研究以液相色谱-串联质谱为平台实现对自然衰老小鼠肝脏与血清代谢物的批量定性定量分析，发现核酸代谢通路有伴随衰老下调的趋势。本研究为继续深入开展衰老研究提供了代谢组学数据资源。

A.年老组对年轻组OPLS-DA模型得分散点图(负离子模式鉴定到的小鼠血清代谢物)；B.年老组对年轻组OPLS-DA模型得分散点图(正离子模式鉴定到的小鼠血清代谢物)；C.年老组对年轻组OPLS-DA模型的置换检验结果(200次置换，负离子模式鉴定到的小鼠血清代谢物)；D.年老组对年轻组OPLS-DA模型的置换检验结果(200次置换，正离子模式鉴定到的小鼠血清代谢物)；E.衰老上调的小鼠血清代谢物的KEGG通路分析；F.衰老下调的小鼠血清代谢物的KEGG通路分析

A.小鼠肝脏与血清鉴定代谢物的韦恩图；B.小鼠肝脏与血清伴随衰老发生差异改变的代谢物的韦恩图；C.小鼠肝脏与血清的衰老相关的28个共同差异代谢物的KEGG通路分析