DOT1L对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响及其作用机制*

王洪伸, 林涌鹏, 尹萌辰, 常君丽, 陈博来△

1广州中医药大学第二附属医院骨伤一科(广东广州 510120)； 上海中医药大学附属龙华医院 2骨伤科, 3上海中医药大学脊柱病研究所(上海 200032)

骨肉瘤是起源于骨间叶细胞的原发恶性骨肿瘤，约占恶性骨肿瘤的20%，其发病年龄呈双峰状，75%发生于儿童和青年为原发性；25%发生于中老年为继发性[1-3]。首次确诊后转移患者5年生存率低于30%，具有极高危害性[4]。因此寻找有效的药物治疗靶点临床迫切需要，而DNA损伤与修复途径一直是关注靶点。骨肉瘤DNA损伤后无法及时修复，将逐步导致细胞增殖和分化失控，诱发恶性增殖[4-5]；而DNA损伤修复功能过强，将导致细胞修复加速，增加肿瘤发生率或耐药性和抵抗力[5]。DOT1L催化H3K79甲基化促进DNA损伤修复、端粒酶沉默[6]。有肿瘤细胞测序报道和CBioPortal肿瘤数据库表明，DOT1L在部分肉瘤中呈高表达[7]；而SIRT1在骨肉瘤中呈现促癌基因高表达特性[8-9]，参与DNA双链损伤修复[8]，能够与DOT1L相互作用，增强H3K79甲基化的分布和活性。因此推测DOT1L可能通过DOT1L/H3K79me2-SIRT1及下游途径调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、转移等生物学行为。为验证上述科学假设，2019年1月至2020年9月，本研究首次采用shRNA敲减骨肉瘤细胞DOT1L基因，观察MG63细胞增殖、迁移、DNA损伤的影响，探讨DOT1L成为骨肉瘤治疗新靶点的具体机制与潜能。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人骨肉瘤细胞株MG63购自上海中科院细胞库；MEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，DOT1L抗体(ab64077)、XPA抗体(ab85914)、XPC抗体(ab155025)、H3K79me2(ab3594)、Histone H3抗体(ab1791)、β-actin抗体 (ab8227)均购自美国Abcam公司，SIRT1抗体(#8469)购自美国Cell Signaling Technology公司。hDOT1L shRNA TRC系列质粒购自美国GE Healthcare Dharmacon公司。RIPA裂解液、SDS缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus试剂盒、TUNEL试剂盒、DAPI等均购自上海碧云天公司，RNA提取试剂盒和逆转录cDNA试剂盒均购自Invitrogen公司；EMLBSLR显微镜购自日本Leica公司、BH-20光学显微镜购自日本Olympus公司。酶标仪、细胞培养箱来自美国赛默飞科技公司、CKX31普通光学显微来自日本奥林巴斯公司，细胞培养板购自美国Corning公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养与转染 MG63细胞用含10%胎牛血清的MEM 培养基，于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养，每天更换新鲜培养液，待细胞生长融合至70%～80%进行传代。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书的方法，将hDOT1L-shRNA及其阴性对照(shRNA-Scramble)转染至MG63细胞，定义为hDOT1L-shRNA组和Scramble组；培养4～6 h后更换新鲜完全培养基，继续培养24 h后，嘌呤霉素筛选收集各组细胞进行后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR检测MG63细胞中DOT1L mRNA的表达 用RNA提取试剂盒分别提取各组细胞中的总RNA，将提取的总RNA按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤逆转录为cDNA，然后用RealtimePCR检测各组细胞中DOT1L水平。PCR反应体系：ddH2O 7.2 μL，SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10.0 μL，10 μmol/L前后引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，终体积为20 μL。扩增条件：94℃预变性10 min(94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s)40个循环。DOT1L PCR引物序列：正向引物为：5′-GAAGAGCAGTGAGAAGGGC-3′，反向引物为：5′-TTTTCAAGTGTGGACGAGG-3′，GAPDH 正向引物为：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向引物为：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，采用2-△△CT法分析内参对照组和目的基因组之间的表达差异。实验重复3次。

1.4 MTT法及检测MG63细胞的增殖能力 转染完成后调整细胞浓度为5×104·mL-1，接种至96孔培养板(100 μL/孔)，37℃、5% CO2培养箱内培养，分别在24、48、72 h后在避光环境下每孔加入5 mg/mL MTT(10 μL/孔)，37℃、5%CO2培养箱内培养避光孵育3～4 h，弃去上清液，加入200 μL DMSO，室温于摇床振荡10 min，用酶标仪492 nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞增殖影响的分析。

1.5 划痕实验检测MG63细胞的迁移能力 取3.5 cm直径培养皿背侧均匀划横线，间隔0.5～1 cm，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。取对数生长期MG63细胞，调整细胞浓度为3×105·mL-1，接种于3.5 cm培养皿(2 mL/皿)，常规培养24 h后采用Lipofectamine 2000制备转染复合物，转染成功后继续培养6 h，弃去上清液，200 μL枪头垂直于背侧横线划痕，PBS清洗脱落细胞并弃除上清液。继续培养48 h，分别于倒置显微镜下记录0、48 h的细胞迁移，根据距离计算细胞迁移率。实验重复3次。

1.6 TUNEL法检测细胞DNA损伤 收集对数生长期MG63细胞，调整细胞浓度为1×104·mL-1，接种于96孔培养板(100 μL/孔)，常规培养24 h，Lipofectamine2000与hDOT1L-Scramble、hDOT1L-shRNA质粒制备转染复合物，每孔质粒2.5 μg，转染6 h后，更换新的完全培养基继续培养48 h。按照TUNEL试剂盒说明书进行检测，封片拍照。

1.7 彗星实验检测细胞DNA损伤 收集对数生长期MG63细胞，调整细胞浓度为5×104·mL-1，接种于6孔培养板(2 mL/孔)，常规培养24 h，制备Lipofectamine2000与质粒转染复合物，每孔加入质粒2.5 μg，转染6 h后更换新的完全培养基，继续培养至48 h，收集细胞。彗星实验采用三层凝胶结构，第1层为正常熔点琼脂糖，第2层为低熔点琼脂糖和细胞核悬浮液的混合层，第3层为低熔点琼脂糖。裂解时移去每组细胞盖玻片，浸入细胞裂解液，4℃裂解90 min，然后在碱性电泳缓冲液中碱解旋20 min。继续进行单细胞电泳，调整电压为25 V、电流300 mA，电泳10～15 min结束后，每片载玻片上滴加100 μL 30 μg/mL的溴化乙锭溶液，避光染色10 min后在荧光显微镜下观察并拍照，计算拖尾率。利用Comet Assay Software Pect(CASP 1.2.3 beta 1)图像分析软件对彗星图像进行分析。根据拖尾细胞中彗星尾部DNA含量(Tail DNA%)，将细胞DNA损伤程度分为5级。0级：无损伤(正常细胞)及细胞损伤率<5%；1级：低度损伤，5%～20%；2级：中度损伤，～40%；3级：高度损伤，～90%；4级：重度损伤，>95%。

1.8 蛋白质印迹分析法检测MG63细胞DOTL1/SIRT1/XPA轴蛋白表达 实验分组及质粒转染方法同前，转染48 h后。收集细胞按照裂解液提取总蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取100 μg蛋白加入5×SDS煮沸变性。丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，根据目的蛋白制作10%～15%丙烯酰胺凝胶分离胶和5%浓缩胶)，室温封闭2 h，分别加入一抗(DOT1L、SIRT1、XPA、H3K79me2、Histone H3、β-actin，稀释比例均为1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤，滴加ECL显色、定影、扫描免疫印迹。

2 结果

2.1 转染后MG63细胞中DOT1L mRNA表达水平 实时荧光定量PCR结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组的DOT1L mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示hDOT1L-shRNA转染成功，可用于后续实验。见表1。

表1 RT-PCR法分析两组MG63细胞中DOT1L mRNA表达量

2.2 敲减DOT1L对MG63细胞的增殖能力的影响 MTT实验结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组MG63细胞24、48、72 h时的OD值均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 MTT法检测两组MG63细胞不同时间点的增殖抑制情况

2.3 细胞划痕实验检测敲减DOT1L对MG63细胞迁移能力的影响 划痕实验检测结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组MG63细的迁移率降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1、表3。

图1 DOT1L对MG63细胞迁移能力的影响

表3 细胞划痕实验检测两组MG63细胞迁移率

2.4 TUNEL法检测敲减DOT1L对MG63细胞DNA损伤的影响 TUNEL检测结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组MG63细胞的DNA损伤荧光强度明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、表4。

图2 敲减DOT1L对MG63 DNA损伤的影响(TUNEL)

表4 TUNEL法检测两组细胞DNA损伤凋亡情况

2.5 彗星实验检测下调DOT1L对MG63细胞DNA损伤的影响 彗星实验结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组MG63细胞DNA损伤率明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表5。

图3 DOT1L对MG63 DNA损伤的影响(彗星实验)

表5 彗星实验检测两组MG63细胞DNA损伤

2.6 DOT1L对MG63细胞DOT1L/H3K79me2-SIRT1L-XPA相关蛋白表达水平的影响 Western blot检测结果显示，与Scramble组相比，hDOT1L-shRNA组MG63细胞中DOT1L、SIRT1、XPA、H3K79me2蛋白表达均降低，组蛋白H3表达总量不变。见图4。

图4 下调DOT1L对MG63 细胞DOT1L/H3K79me2-SIRT1L-XPA相关蛋白表达的影响

3 讨论

骨肉瘤因其高恶性度、高致残率、高复发转移率，耐药性强的等因素导致死亡率居高不下，因此其新药物靶点开发一直是研究热点。最近研究发现组蛋白甲基转移酶在骨肉细胞中异常表达或基因突变，与细胞周期、上皮-间质转分化、细胞凋亡多种机制密切相关，目前发现G9a、EHZ2、NSD家族、PRMT1、PRMT4/CARM1、PRMT6等，主要通过调控组蛋白H3不同位点甲基化调控基因转录，调控骨肉瘤进展[10]。

DOT1L能催化染色质组蛋白H3K79一、二、三甲基化影响转录进程，具有维持细胞基因组稳定的重要功能[6，9]。DOT1L在白血病、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等中呈现抑癌/促癌的不同特性[9，11]，但骨肉瘤中尚未研究。本研究首次发现敲减DOT1L可抑制MG63细胞增殖和迁移，延迟DNA损伤修复。

SIRT1去乙酰化p53、FoxO3a、Ku70、WRN、NBS1等多个DNA双链损伤相关蛋白，影响其稳定性及活性[12-13]。骨肉瘤中SIRT1基因表达增高，参与骨肉瘤EMT介导的细胞迁移[8]，调控SIRT1可改善骨肉瘤的化疗后耐药性[14]。小鼠肾内髓质上皮细胞mIMCD3中SIRT1蛋白与DOT1L相互结合，促进DOT1L对H3K79甲基化[15]，表明SIRT1可能参与了DOT1L催化H3K79双甲基化促进DNA修复。

XPA基因是核苷酸切除修复(NER)过程必须，其缺失将导致细胞内NER进程阻滞、突变积累，基因组稳定性下降，最终导致癌症发生或复发，提示XPA可能是NER过程的限速酶之一[16]。此外，XPA基因突变导致XPF和XPG在DN中结合方式改变，由持续变为间断机制，酶活性受到限制，抑制NER途径修复[17]。在UV诱导的DNA损伤修复中，SIRT1通过调控XPA乙酰化/去乙酰化，并与乙酰化XPA形成蛋白复合体[18]。

综合上述分析得到科学假设：DNA损伤后启动修复中，DOT1L、SIRT1、XPA形成级联调节。具体机制是：DOT1L催化H3K79 me2交联与核小体上，继而招募SIRT1蛋白与DOT1L蛋白形成复合体，再招募乙酰化XPA蛋白相互结合，即DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA级联调节。

本研究通过敲减DOT1L发现H3K79me2、SIRT1、XPA蛋白降低，提示DOT1L可能通过本信号级联调节调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和DNA损伤。但上述蛋白的相互结合，应通过免疫共沉淀研究证实，是本研究未完善之处。此外，本研究中未设空载质粒对照对照组，系因项目组shRNA TR系列质粒购自美国GE公司，含Scramble质粒1个，载shRNA质粒5个，未提供空载质粒，本研究经PCR验证敲除效率选取效率最佳者进行后续研究，对照组仅使用对照更加严格的Scramble乱序对照，保证实验结果可靠性。

综上所述，敲减DOT1L基因表达，可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移能力，诱导DNA损伤加剧，其机制是通过调控DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA信号通路实现，但这一作用机制有待进一步通过免疫共沉淀等技术，以及在体内和体外实验证明，这是本研究尚需完善之处。