结肠直肠癌B7S1表达与免疫浸润的关系

王常刚， 刘 坤， 冯浩然， 蒋奕玫， 施毅卿， 陈献则，宋子甲， 李 军， 李 佑， 蔡东莉，赵 任,2

[1.上海交通大学医学院附属瑞金医院（北部院区）普外科，上海 201800；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院外科，上海 200025；3.同济大学附属上海市第一妇婴保健院临床转化医学研究中心，上海 200011]

据《全球癌症统计报告》统计，2018年全球新增结肠直肠癌 (colorectal cancer，CRC)病例超过180万例，死亡88.1万例［1］。其死亡率分别列于中国和美国恶性肿瘤死亡率第5位和第2位［2］。得益于术后辅助化疗/新辅助治疗和手术技术的改进，CRC病人的预后在过去几十年中有所改善，但生存率仍不高。转移性CRC病人的5年生存率仅为14%［3］。

B7S1是B7超家族成员之一，B7S1 mRNA(又称VTCN1)在绝大多数人恶性肿瘤中异常表达。多种实体肿瘤中B7S1表达与肿瘤表型相关，如淋巴结转移、肿瘤分期、肿瘤分化程度、复发转移，并与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)浸润强度相关。利用公共数据库分析VTCN1在CRC的表达及其与CRC临床特征、免疫细胞浸润以及预后的相关性，通过免疫荧光技术检测B7S1在CRC的表达特征，为CRC免疫治疗靶点选择提供依据。

资料与方法

一、公共数据库检索

本研究在6个数据库：①Oncomine肿瘤芯片数 据 库 (https：//www.oncomine.org/resource/login.html，查询参数为：P<0.05,fold-change＞2以及gene ranking in ALL)； ②TIMER 数据库(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/，肿瘤浸润免疫细胞综合分析)；③Kaplan-Meier Plotter 数 据 库 (https：//kmplot.com/analysis/，基于荟萃分析的生存生物标志物的发现和验证)；④UALCAN 数据库(http：//ualcan.path.uab.edu/index.html，利用交互式网络资源用于分析癌症组学数据)；⑤LinkedOmics数据库(http：//www.linkedomics.org/login.php，来自32种癌症类型和10个临床蛋白质组学肿瘤分析联盟癌症队列的多组学数据)；⑥人类蛋白质图谱数据库(https：//www.proteinatlas.org/，human protein atlas database，利用各种组学技术绘制细胞、组织和器官中的所有人类蛋白质图谱)，筛选评估VTCN1表达水平及其与CRC临床病理特征和病人预后的关系。

二、标本收集

收集2019年1月至12月间，在上海交通大学医学院附属瑞金医院 (北部院区)CRC根治手术病人的肿瘤组织和距肿瘤组织边缘＞5 cm正常组织标本，共24例，其中男14例(结肠癌9例，直肠癌5例)，平均年龄(61.4±4.0)岁,女 10例(结肠癌5例，直肠癌 5例)，平均年龄(66.6±2.9)岁，术后病理诊断均为腺癌。标本于4%多聚甲醛固定保存。病人为首次确诊、未行放化疗以及无远处转移。研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院北部院区伦理委员会批准。

三、免疫荧光染色

①石蜡切片制备：每例取一小块肿瘤组织及正常组织分别固定于4%多聚甲醛中，用石蜡包埋。用组织切片机切下2片厚度5～6 μm的组织，分别贴于阳离子防脱玻片上，37℃烘箱过夜干燥。②将切片置于玻片盒，二甲苯中脱蜡、乙醇中脱水。漂洗后甩去切片上多余水分，注意防止组织过度干燥。③抗原修复：将切片置于1×抗原修复液中，95～100℃保温20 min后，置于室温，待抗原修复液自然冷却至室温。④1×PBS漂洗后用含10%驴血清的1×PBS室温封闭30 min。⑤甩干封闭液后，加适量5%驴血清抗体稀释液配制的一抗 (anti-human B7S1：Biolegend 公司，Cat#358101；anti-human CD45：Abcam 公司，Cat#ab10559)混合液4℃封闭过夜。⑥1×PBS漂洗，加1%驴血清适量抗体稀释液配制的二抗［AffiniPure F(ab’)2 Fragment donkey anti-rabbit/mouse/goat immunoglobulin］混合液室温 30 min。 ⑦1×PBS漂洗，用含DAPI的封片剂封片。⑧用Zeiss(LSM780)倒置荧光显微成像系统采集图像信息。⑨使用ImageJ软件进行定量分析。

四、统计学分析

使用Prism 6.0软件(GraphPad)进行统计学分析。所有值用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、B7S1 mRNA在CRC中的表达水平

Oncomine数据库检索分析显示，与正常组织相比，CRC的VTCN1表达在6个数据集中均增加。此外，VTCN1在宫颈癌、食管癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌中也升高，而在乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌中的表达较低(见图1A)。为进一步评估CRC中VTCN1表达水平差异，使用TIMER数据库分析TCGA RNA测序数据验证VTCN1的表达(见图1B)。结果显示CRC组织中VTCN1的表达明显高于正常肠道组织。

图1 VTCN1在不同肿瘤类型中的表达

与正常组织相比，VTCN1在多种CRC亚型中高表达，包括结肠腺癌(P=1.34×10-9)、结肠黏液腺癌(P=6.91×10-7)、盲肠腺癌(P=7.40×10-7)、直肠腺癌(P=4.56×10-10)、直肠黏液腺癌(P=0.001)、直肠乙状结肠腺癌(P=0.019)(见表1、图2)。

图2 Oncomine数据库分析CRC组织和正常组织VTCN1的表达

表1 B7S1 mRNA在不同类型CRC中的表达水平差异（Oncomine数据库）

二、B7S1 mRNA与CRC临床病理特征的关系

从UALCAN数据库中的TCGA数据进一步研究VTCN1与CRC临床病理特征间的关系。结果发现除Ⅱ期直肠癌(P=1.65×10-1)，其余不同分期的结肠直肠癌组织与正常组织中的VTCN1表达水平均存在显著差异。分别为Ⅰ期结肠癌(P=7.38×10-4)、Ⅱ期结肠癌(P=1.17×10-4)、Ⅲ期结肠癌(P=1.86×10-3)、Ⅳ期结肠癌(P=4.85×10-2)，Ⅰ期直肠癌(P=4.06×10-2)、Ⅱ期直肠癌 (P=1.65×10-1)、Ⅲ期直肠癌(P=1.06×10-2)、 Ⅳ期直肠癌 (P=1.46×10-2)(见图3)。在淋巴结转移方面，亦存在一定差异。除直肠癌N0(P=1.14×10-1)，其余差异均有统计学意义。分别为结肠癌 N0(P=1.42×10-6)、N1(P=3.58×10-4)、N2(P=6.50×10-3)，直肠癌 N1(P=4.69×10-3)、N2(P=1.59×10-2)(见图 3)。

图3 UALCAN数据库查询VTCN1与CRC不同分期及淋巴结转移的关系

同时，通过LinkedOmics数据库分析TCGA数据，发现VTCN1与CRC的M分期存在一定的相关性。主要为有远处转移的病人VTCN1表达水平显著高于未转移的病人，M1与M0差异有统计学意义(P=4.98×10-2)。在CRC的错配修复(mismatch repair，MMR)方面，VTCN1与其具有一定的相关性，表现为微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)较微卫星稳定(microsatellitestable，MSS)的VTCN1表达水平显著升高(P=1.55×10-6)(见图 4)。

图4 LinkedOmics数据库查询VTCN1与CRC远处转移及MSI的关系

三、VTCN1与CRC预后的相关性

通过包含TCGA RNA测序数据的人类蛋白质图谱数据库来分析VTCN1与CRC预后的相关性。结果显示VTCN1表达水平高低与CRC的总生存率不相关(P=0.30)(见图5A)。TNMⅢ～Ⅳ期结肠癌中，VTCN1低表达与总生存率的增加相关(P=0.008)(见图5B)，TNM Ⅲ～Ⅳ期直肠癌中，VTCN1高表达却相对拥有更好的总生存率(P=0.012)(见图5C)。

在Kaplan-Meier Plotter数据库对直肠癌VTCN1表达与总生存率的相关性作进一步分析，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期直肠癌VTCN1高表达组总生存率有相对增加的趋势。对比VTCN1低表达组及高表达组总生存率，Ⅰ期直肠癌(P=0.34)(见图5D)和Ⅱ期直肠癌(P=0.14)(见图5E)中差异无统计学意义，Ⅳ期直肠癌的VTCN1表达与生存率相关性有统计学意义(P=0.007 1)(见图5G)。与此不同的是Ⅲ期直肠癌，其VTCN1低表达组预后更好 (P=0.003 2)(见图5F)。这可能与不同CRC以及不同临床分期肿瘤微环境相关。

图5 人类蛋白质图谱数据库/Kaplan-Meier Plotter数据库的VTCN1与CRC总生存率的相关性

四、VTCN1与CRC肿瘤浸润免疫细胞/粒细胞有关

分析VTCN1与免疫细胞/粒细胞浸润的相关性，包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。结果表明，结肠癌组织VTCN1的表达与 B细胞 (P=1.09×10-3)、CD8+T细胞(P=7.60×10-4)、中性粒细胞(P=1.80×10-2)、树突状细胞(P=5.40×10-3)的浸润水平呈显著正相关。直肠癌组织中VTCN1的表达与CD8+T细胞 (P=1.29×10-2)、中性粒细胞(P=4.24×10-2)的浸润水平呈正相关，差异有统计学意义(见图6)。当然，由于结肠癌及直肠癌的肿瘤纯度不显著 (分别为P=0.05、P=0.7)，VTCN1与此6种免疫细胞浸润的具体相关性仍有待进一步研究。

图6 TIMER数据库查询VTCN1与CRC肿瘤浸润免疫细胞/粒细胞的相关性

五、B7S1在CRC微环境中蛋白质表达水平的差异

从蛋白质水平评估B7S1在CRC肿瘤微环境中的表达。为检测CRC肿瘤组织中B7S1的表达模式，收集24例CRC样本，对正常肠道组织、CRC标本进行抗CD45、抗B7S1的免疫荧光染色。结果显示，在肿瘤组织切片中，B7S1表达水平明显高于正常组织(P<0.000 1)(见图7A、B)，同时在肿瘤组织中B7S1在CD45-及CD45+免疫细胞中均有表达，提示CRC组织及免疫细胞均上调表达B7S1(见图7A)。表明B7S1可能参与CRC肿瘤免疫调控过程。

图7 免疫荧光染色分析B7S1在CRC的表达

讨 论

肿瘤免疫治疗，特别是免疫检查点阻断治疗成为包括CRC在内多种实体瘤的一种极具潜力的治疗手段［4］。在CRC中，肿瘤浸润的CD8+T淋巴细胞被认为是介导抗肿瘤免疫反应的主要效应细胞，其浸润程度可作为判断肿瘤预后的指标［5］。然而，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞会利用各种条件负向调控CD8+T淋巴细胞的作用，以逃避免疫监视、促进肿瘤进展，其中包括上调共抑制性免疫检查点分子［6］。免疫检查点分子主要来自B7-CD28超家族和肿瘤坏死因子受体超家族。参与T淋巴细胞活化第2信号，包括共刺激性和共抑制性分子，通过增强或减弱T淋巴细胞受体下游信号，精确调控T细胞的激活程度和应答强度。研究证实，阻断共抑制性免疫检查点分子可增强CD8+TIL的抗肿瘤活性并维持其高度持久的抗肿瘤免疫反应［7］。目前利用免疫检查点拮抗型单抗对肿瘤进行人工干预，以延缓CD8+T淋巴细胞衰竭，提高抗肿瘤免疫应答效应已在临床上显示明显有效的抗肿瘤疗效［4］。

程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)/PD-L1单抗属于经典的免疫检查点拮抗剂，目前在多种实体瘤中表现出持久、有效的抗癌效果［8］。研究指出，PD-1拮抗剂nivolumab和pembrolizumab在转移性CRC病人中疗效显著。这些病人具有高水平的MSI-H或错配修复缺陷(different mismatch repair,dMMR)［9-10］。 然而， 由于MSI-H或dMMR在CRC中的发生率仅约15%［9］。绝大多数微卫星稳定或微卫星不稳定水平较低(microsatellite instability-low,MSI-L)的CRC病人对此类治疗的应答显得尤为温和［9］。因此，需针对CRC筛选出更有价值的免疫治疗靶点。

虽然其经典的PD-1及其配体PD-L1阻断治疗在多种实体瘤中表现出持久有效的广谱抗癌效果，但仅有部分病人受益于此类治疗方案［8］。因此，亟待针对特定肿瘤筛选出特异性的免疫治疗靶点。PDL1所属的B7家族目前已知成员包括CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1(B7-H1)、PD-L2(B7-DC 或CD273)、ICOSL(B7-H2)、CD276(B7-H3)、B7S1(B7-H4、B7x 或 Vtcn1)、VISTA (B7-H5、GI24 或 PD-1H)、B7-H6 和 B7-H7(HHLA2)［11］。

本研究利用公共数据库对VTCN1在CRC中的表达及其与临床特征的相关性进行系统分析。利用免疫荧光染色技术检测B7S1蛋白水平在CRC肿瘤微环境中的表达和分布特征。无论是mRNA还是蛋白质水平，B7S1在正常肠道组织和CRC中均有一定程度的表达，只是在恶性肿瘤中其表达量明显上调，说明B7S1在CRC发生、发展中可能发挥重要调控作用。分析发现，VTCN1表达水平在不同类型的CRC中差异有显著统计学意义，提示B7S1的表达量可能受不同肿瘤微环境影响。此外，VTCN1水平与CRC的分期、淋巴结转移及远处转移存在相关性，并与MMR状态也存在一定联系。在不同临床分期或不同亚型CRC中，VTCN1表达水平和总生存率之间的相关性有一定差异。这也可能与不同肿瘤类型、不同临床分期的肿瘤微环境差异相关。

在蛋白质水平，与 PD-L1 类似［2］，与正常肠道组织比较，B7S1在CRC组织中表达上调。不同的是，PD-L1在 CRC中主要表达在 CD45-细胞上，而B7S1在CD45-和CD45+细胞上均有表达。在肝癌中，CD45+免疫细胞上表达的B7S1主要分布在巨噬细胞，髓样树突状细胞和单核细胞骨髓源性抑制细胞等髓样细胞上［12］。B7S1假设性受体被诱导表达在活化的T淋巴细胞表面［12-13］。B7S1及其受体的表达模式，强烈提示B7S1在调控T淋巴细胞活化中的作用。B7S1和PD-1/PD-L1联合阻断在肝癌动物模型中表现出明显的协同效应。鉴于B7S1在CRC中的特征，B7S1联合PD-1/PD-L1阻断治疗可能是一种新的CRC治疗策略。然而，包括本研究在内的其他相关探索样本量小，缺乏系统性研究。因此，需对更大样本量的CRC病人进行详细的检测分析，以解决此重要问题。