宫颈癌DExH-box解旋酶9抑制转录本来源的长链非编码RNA在高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤过程中的作用及其机制

马 健 杨维维 李 帅 袁敏杰 魏 盟

全球范围内,受糖尿病影响的成年人数量迅速增长，预计到2030年将达到近4亿[1]。现已证实，高血糖导致的心肌细胞氧化应激损伤是糖尿病心肌病变的重要原因和始动因素[2]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱导的氧化应激损伤在糖尿病心肌病变的发生、发展过程中起着关键作用[3-5]。高血糖能够加重葡萄糖氧化和增加线粒体ROS的生成，导致心肌细胞DNA的损伤，加速细胞凋亡。

长链非编码(lnc)RNA是一类转录长度超过200个核苷酸且不具编码蛋白质功能的RNA分子，广泛分布于细胞核与细胞质内。lncRNA广泛参与肿瘤、心血管疾病、肾脏病在内的多种复杂性疾病的发生与发展。宫颈癌DExH-box解旋酶9(DHX9)抑制性转录物(cervical cancer DExH-box helicase 9 suppressive transcript，CCDST)来源的lncRNA(lnc-CCDST)在宫颈癌组织中显著下调,lnc-CCDST负调控宫颈癌的细胞迁移、侵袭和血管生成，其在许多组织中均有表达，参与机体的正常发育、生理活动，以及多种疾病的发病过程[6-8]。lnc-CCDST参与心血管的细胞代谢过程[9]，而lnc-CCDST与糖尿病心肌病变的关系鲜见报道。本研究利用糖尿病小鼠模型和高糖诱导新生小鼠心肌细胞(neonatal mouse cardiomyocyte，NMC)模型探讨lnc-CCDST对心肌细胞氧化应激损伤、细胞凋亡的影响。

微RNA(microRNA，miRNA)的长度约为22个核苷酸，通过与3’-非翻译区(untranslated region,UTR)、5’-UTR和(或)靶信使RNA(mRNA)编码区的互补位点碱基配对，在调控靶基因表达中发挥重要作用。根据最近提出的竞争性内源性RNA假说，多个lncRNA转录物可以通过其miRNA结合位点充当miRNA的内源性诱饵，调节彼此的生物活性。基于此,提出了lnc-CCDST是否也能以类似于蛋白质编码基因的方式与miRNA相互作用的问题。通过在线数据库预测及分析发现，miRNA-339-5p(miR-339-5p)可能负向调节lnc-CCDST的表达。因此，本研究进一步探讨lnc-CCDST受miR-339-5p负向调节的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 取4～6周龄SPF级雄性Balb/C小鼠40只(体重为20～22 g)和出生1～2 d新生小鼠60只，均由上海西普尔-必凯实验动物公司实验动物中心提供。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司； 杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)和抗生素购自美国Gibco 公司；45%葡萄糖液购自美国Sigma公司；小干扰RNA(siRNA)siCCDST-1、siCCDST-2和阴性对照scramble siRNA(si-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma)；miR-339-5p mimic和阴性对照购自美国Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型的建立及实验分组 将40只雄性小鼠以普通饲料适应性喂养1周，取其中20只小鼠建立糖尿病小鼠模型(模型组)。方法为麻醉后腹腔内注射1%STZ 50 mg/(kg·d)，连续5 d，最后一次注射STZ 72 h后测血糖，如血糖>15.0 mmol/L则确诊为1型糖尿病。另20只小鼠用柠檬酸盐缓冲液处理后作为对照组(血糖<12.0 mmol/L)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测两组小鼠心肌细胞的lnc-CCDST表达。

1.2.2 NMC细胞培养 60只新生小鼠制备NMC，制备方法：取新生小鼠心脏用胶原酶和蛋白酶消化10 min，小心分离收集心肌细胞，使用含5% FBS的最低基本培养基(MEM)于37 ℃、二氧化碳(CO2)体积分数为0.05条件下培养。NMC细胞分组处理如下：细胞接种于六孔板，正常糖组培养基为正常葡萄糖浓度的DMEM；高糖组培养基含35 mmol/L的D-葡萄糖。干预时间为24 h。每组至少重复3次。采用qRT-PCR检测各组细胞的lnc-CCDST表达。

1.2.3 使用siRNA抑制lnc-CCDST表达 将设计好的siCCDST-1(5’-CTT GTG AAG TCT ATG AAT ATT-3’)、siCCDST-2(5’-AGC ACA ACC TTG GAG AAT AAA-3’)，以及si-NC通过TransMessenger转染试剂盒(Qiagen)转染NMC。转染24 h后，采用qRT-PCR检测NMC的lnc-CCDST表达。后续选择si-NC和抑制效率高的siRNA抑制NMC lnc-CCDST表达，分别在正常糖和高糖条件下培养24 h，测定细胞内ROS含量、胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性，以及DNA片段(DNA fragmentation)。ROS荧光探针(DCF-DA)检测细胞内ROS的产生，通过荧光显微镜记录DCF-DA信号(Invitrogen)；使用荧光测定试剂盒(Biomol Research Laboratories)测定细胞内caspase-3的活性；使用DNA fragmentation ELISA试剂盒检测细胞DNA fragmentation (瑞士罗氏公司)，各检测结果以其与正常糖培养条件下si-NC组的比值表示，每组至少重复3 次。

1.2.4 验证lnc-CCDST的调控因子 经miRcode软件预测miR-339-5p，miRNA-4637(miR-4637)和miRNA579-3p(miR-579-3p)可能是调控lnc-CCDST表达的miRNA。采用Trans Messenger试剂盒将合成的miR-339-5p、mimic、miR-4637 mimic及miR-579-3p mimic转染NMC,过表达细胞miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，使用错义寡核苷酸(scrambled oligonucleotide)作为对照；选择对lnc-CCDST有明显抑制作用的miRNA，合成其化学修饰的反义寡核苷酸(antagomir，GenePharm)抑制该miRNA表达，仍使用scrambled oligonucleotide作为对照。利用TransMessenger转染试剂盒进行转染。采用qRT-PCR检测各组lnc-CCDST的表达。每组至少重复3 次。

1.2.5 高糖刺激下过表达miR-339-5p对NMC的氧化应激损伤和细胞凋亡的影响 利用miR-339-5p mimic和scrambled oligonucleotide转染NMC，再分别予正常糖和高糖刺激并检测各组细胞内ROS含量、caspase-3活性，以及DNA fragmentation，结果以其与相应对照组的比值表示，每组至少重复3 次。

1.2.6 调节lnc-CCDST表达，分析miR-339-5p对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用 将lnc-CCDST基因克隆至表达载体质粒pcDNA3.1(+)中，在高糖诱导处理的NMC中过表达lnc-CCDST。所有质粒均经测序证实，利用脂质体3000试剂(美国Invitrogen公司)进行质粒转染。设立对照组、miR-339-5p过表达组、lnc-CCDST过表达组，以及miR-339-5p+lnc-CCDST共过表达组，检测各组细胞内caspase-3活性和DNA fragmentation，结果以其与相应对照组的比值表示，每组至少重复3 次。

2 结 果

2.1 高糖对lnc-CCDST表达的影响 与正常小鼠比较，糖尿病模型小鼠心肌组织中lnc-CCDST表达显著增加(1.14±0.67 比 5.22±3.48,P<0.01)。与正常糖组比较，高糖组NMC中lnc-CCDST表达显著增加(1.00±0.00比2.54±0.72，P<0.01)。

2.2 抑制lnc-CCDST表达对高糖诱导的NMC氧化应激损伤和细胞凋亡的影响 与si-NC比较，siCCDST-1、siCCDST-2均可显著抑制NMC中lnc-CCDST表达(1.00±0.00比0.41±0.11、0.49±0.08，P值均<0.05)，siCCDST-1抑制效果更为显著，故以下实验使用siCCDST-1进行。与正常糖组相比，高糖组NMC内ROS含量和DNA fragmentation均显著增加、caspase-3活性上升(P值均<0.05)，提示氧化应激相关的细胞凋亡显著增多。而抑制lnc-CCDST能够减少高糖诱导的NMC内ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。见表1。

表1 抑制lnc-CCDST表达对高糖诱导的NMC氧化应激损伤和细胞凋亡的影响

2.3 miR-339-5p负向调节lnc-CCDST表达 应用DIANA-LncBase 和 miRcode软件分析证实，miR-339-5p存在与lnc-CCDST的结合位点，见图1。分别于NMC中过表达miR-339-5p、miR-4637和miR-579-3p，检测发现过表达miR-339-5p抑制lnc-CCDST最为显著，miR-339-5p组细胞lnc-CCDST的表达显著低于对照组(0.45±0.09比1.00±0.00，P<0.05)；miR-4637和miR-579-3p组细胞lnc-CCDST的表达分别为0.68±0.32、0.93±0.27，与对照组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。在此基础上，进一步利用antagomir抑制miR-339-5p表达，lnc-CCDST的表达(1.83±0.43)随之增加，与对照组间的差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-339-5p与lnc-CCDST的结合位点

2.4 miR-339-5p对高糖诱导引起的NMC氧化应激损伤及细胞凋亡的影响 过表达miR-339-5p能够减少高糖诱导后心肌细胞内ROS含量、降低caspase-3活性、抑制DNA fragmentation的增加(P值均<0.05)。见表2。

表2 miR-339-5p对高糖诱导引起的NMC氧化应激损伤及细胞凋亡的影响

2.5 过表达lnc-CCDST抵消miR-339-5p对NMC氧化应激损伤的保护作用 过表达miR-339-5p后，高糖诱导的NMC中caspase-3活性显著降低，DNA fragmentation显著减少(P值均<0.05)；在此基础上同时过表达lnc-CCDST可使miR-339-5p过表达组细胞内的caspase-3活性显著升高，DNA fragmentation显著增加(P值均<0.05)。见表3。

表3 过表达lnc-CCDST抵消miR-339-5p对NMC氧化应激损伤的保护作用

3 讨 论

越来越多的证据表明，各种lncRNA通过调节miRNA的表达来发挥其生理、病理功能[10]。同时，miRNA又可进一步调节靶蛋白和lncRNA的表达。lncRNA与mRNA有许多共同特征：均具有复杂的剪接模式，通常由RNA聚合酶Ⅱ转录。lncRNA可能以类似于蛋白质编码基因的方式被调节[11-12]。近年来，关于lncRNA在糖尿病及其并发症中的作用研究引起了广泛关注[13]，而lncRNA调节糖尿病心肌细胞氧化应激损伤的机制研究较为缺乏，故研究lnc-CCDST在糖尿病心肌组织中的表达，以及探讨其与糖尿病心肌细胞氧化应激损伤的关系，将是预防和治疗糖尿病心肌重构和心功能障碍的新的研究方向。

本研究结果显示，无论离体或在体试验，高糖干预后心肌细胞中lnc-CCDST表达均显著增加，提示lnc-CCDST变化可能参与糖尿病心肌细胞氧化应激损伤过程。近年研究[14-15]发现，心肌细胞内ROS生成是糖尿病心肌损伤的重要机制，本研究同样发现，高糖诱导后细胞内ROS生成和细胞凋亡明显增加;而靶向性抑制lnc-CCDST后,心肌细胞中ROS生成、细胞凋亡得到显著逆转，证实 lnc-CCDST可能通过促进心肌细胞内ROS生成、细胞凋亡，进而参与糖尿病心肌细胞氧化应激损伤的过程。本研究结果进一步证明，miR-339-5p与lnc-CCDST之间具有明确的作用位点，且miR-339-5p负向调节心肌细胞中的lnc-CCDST表达；高糖环境下过表达miR-339-5p能够靶向性抑制lnc-CCDST表达,进而减少心肌细胞内的ROS生成及细胞凋亡，最终发挥抗心肌细胞氧化应激损伤的作用，而这一保护作用在过表达lnc-CCDST后被明显抵消。

新近研究明确提示,ROS生成在心肌重构过程中具有重要作用，抑制心肌细胞线粒体ROS生成可以显著逆转心肌重构。与其他课题组研究结论一致，本团队的前期研究[16]结果亦证实,给予靶向性抗氧化剂mito-TEMPO可以有效减少心肌细胞ROS生成并改善糖尿病心肌重构。在此基础上进一步证实上调F0F1-ATP合酶表达及其活性能够减少心肌细胞线粒体ROS生成，并最终改善糖尿病小鼠心肌损伤[17]。而miR-339-5p/lnc-CCDST通路是否直接调节ATP合酶表达，进而影响心肌细胞ROS生成尚不明确，因此也为下一步的研究提供了前提和方向。

本研究证实，miR-339-5p/lnc-CCDST通路参与了高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤及细胞凋亡的过程，其机制与调节心肌细胞ROS生成、caspase-3活性及DNA损伤有关，提示miR-339-5p/lnc-CCDST通路能够影响糖尿病心肌细胞氧化应激损伤及心肌重构。本研究结果将为进一步探索糖尿病心肌病及心脏功能障碍的防治提供理论依据和基础，从心肌细胞代谢角度为糖尿病心肌病变的临床治疗提供新的靶点和方向。