城市河道沉积物溶解性有机质特征及其对反硝化过程的影响研究

翁蕊 韦政 杨燕梅 韩静 何岩 黄民生

摘要： 為了解决城市河道治理过程中氮营养盐去除难题， 城市河道体系中溶解性有机质 （DOM） 对反硝化过程的影响作用值得重视. 研究表明， 河道沉积物中DOM的腐殖化程度较低、芳香性弱， 以小分子的富里酸为主， 其浓度平均为 （1 868.5 ± 63.2） mg/kg. 与空白组相比， DOM可以促进反硝化过程， 对TN和NO3–-N去除率分别提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%， 而DOM协同乙酸盐组对TN和NO3–-N的去除效果更好， 分别可以达到74.48% ± 1.29%和98.62% ± 0.07%. 微生物分析表明， DOM组的菌群多样性和丰富度均高于空白组， 但其中的异养反硝化菌属Pseudomonas和Brevundimonas以及nirK型反硝化菌属Paracoccus的丰度均低于DOM协同乙酸盐组. 此外， DOM运行体系中NH4+-N浓度维持较高的水平 （大于3.7 mg/L）， 而且含有DOM体系中与异化硝酸盐还原成铵 （DNRA） 功能相关的厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter）， 其相对丰度明显增加， 推测DOM在促进反硝化的同时诱导了DNRA过程的发生.

关键词： 城市河道； 溶解性有机质； 反硝化； 富里酸； 异化硝酸盐还原成铵

中图分类号： X522 文献标志码： A DOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.006

Characteristics of dissolved organic matter and its effects on denitrification in urban river sediments

WENG Rui1，2，3，4， WEI Zheng1，2，3，4， YANG Yanmei1，2，3，4， HAN Jing1，2，3，4， HE Yan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4

（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China； 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China； 3. Shanghai Engineering Research Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China； 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）

Abstract： Understanding the impact of dissolved organic matter （DOM） on the denitrification process is critical to addressing the challenges associated with nitrogen removal in urban river treatment. In this paper， we show that DOM in urban rivers are mainly comprised of small-molecule fulvic acids. The humic acid content and aromaticity of the DOM， moreover， were found to be low. Compared with the control case， DOM can promote the denitrification process； specifically， the removal efficiency of TN and NO3–-N in the DOM-added group increased by 7.24% ± 0.36% and 23.52% ± 1.17%， respectively. DOM with an acetate group had an even better effect on the removal of TN and NO3–-N， reaching 74.48% ± 1.29% and 98.62% ± 0.07%， respectively. Microbiological analysis showed that the DOM-added group can significantly increase the diversity and richness of the bacteria community compared with the control case. However， the relative abundance of the heterotrophic denitrifiers Pseudomonas and Brevundimonas as well as the nirKtype denitrifier Paracoccus in the DOM-added group was less than that of the DOM with an acetate group. Additionally， a relatively high concentration of NH4+-N （> 3.7 mg/L） was observed in the DOM-added group. The addition of DOM can significantly increase the relative abundance of Anaeromyxobacter related to dissimilatory nitrate reduction to ammonium （DNRA） functional genes. It is speculated that DOM promotes the denitrification process and induces the DNRA process simultaneously.

Keywords： urban river； dissolved organic matter； denitrification； fulvic acid； dissimilatory nitrate reduction to ammonium

0 引 言

近年来， 随着城市黑臭河道整治工作的相继开展， 水质的黑臭现象逐步得到缓解， 水质也得到了极大改善， 但治理过程中氮营养盐难以去除的问题逐渐凸显[1]. 反硝化被认为是氮的生物地球化学循环中的关键环节， 也是削减河道沉积物内源氮负荷的重要途径. 溶解性有机质 （DOM） 作为沉积物中活跃的组成部分[2]， 在氮素迁移转化过程中的作用日益受到重视.

然而， 当前的研究主要集中在污水处理系统[3]及地下水系统[4]中DOM对反硝化过程的影响， 对于城市河道中DOM对反硝化的影响尚未有定论. 本文探究了城市河道沉积物DOM的赋存特征及其对城市河道反硝化过程的影响作用， 同时解析了相关的微生物作用机制， 为强化城市河道氮素削减提供有益补充.

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验选取上海市普陀区桃浦镇里店浦作为研究对象， 该河是工业河的一条支流， 经整治后黑臭现象消除， 目前出现季节性水华. 实验所采用的上覆水和沉积物均取自该河道， 上覆水pH值为7.39 ± 0.12， 氨氮 （NH4+-N）、硝氮 （NO3–-N） 及总氮 （TN） 的浓度分别为2.03 ～ 3.38 mg/L、2.25 ～ 2.62 mg/L和5.79 ～ 6.58 mg/L， 沉积物中DOM浓度为 （1 868.5 ± 63.2） mg/kg.

1.2 实验模拟体系

采用逐步提高进水NO3–-N浓度 （14 mg/L—28 mg/L—42 mg/L） 的方式对河道沉积物进行定向富集培养. 然后通过预实验确定相对优化的DOM浓度， 发现DOM浓度为72 mg/L时与反硝化成明显的正相关， 因此本实验选取该浓度进行后续实验. 实验所添加的DOM是根据文献[5]所述方法并加以修改后制备： 先将河道沉积物经冷冻干燥 （LABCONCO 6L， 美国） （冷凝箱–55℃， 干燥箱–40℃） 后制得样品， 再研磨过100目筛， 接着按V水∶m土为5∶1的比例称取定量样品于250 mL锥形瓶中， 在转速200 r/min、温度 （30 ± 1）℃下振蕩16 h， 并在4℃、转速12 000 r/min下离心15 min，随后将上清液通过0.45 μm玻璃纤维滤膜， 所得滤液即为DOM.

本实验模拟体系包括空白组、DOM组和DOM协同乙酸盐组. 培养实验使用250 mL血清瓶， 按体积比1∶5加入富集培养好的40 mL沉积物与200 mL反硝化液体培养基， 混合均匀后用氮气向血清瓶顶部鼓吹20 min排除空气， 迅速加盖密封.

1.3 分析方法

本研究所涉及的常规理化指标除pH值直接使用仪器测定外， 总氮 （TN）、氨氮 （NH4+-N）、硝氮（NO3–-N） 及亚硝氮 （NO2–-N） 等均参照标准[6]进行测定. 1.3.1 紫外-可见光谱分析

紫外-可见光谱采用紫外-可见吸收分光光度仪 （UNICO UV4802S， 上海） 测定， 扫描波长（lWL）为200 ～ 700 nm， 石英比色皿光程10 mm， 以Milli-Q超纯水为空白.

1.3.2 三维荧光光谱分析

三维荧光光谱采用荧光分光光度计 （HITACHI F-4500， 日本） 测定， 仪器参数： 激发光源采用150 W氙弧灯； PMT电压为700 V； 激发和发射狭缝宽度均为5 nm； 激发波长 （lEx） 为250 ～ 600 nm， 发射波长 （lEm） 为200 ～ 550 nm， 扫描间隔均是10 nm； 扫描速度为12 000 nm/min； 响应时间自动； 空白为Milli-Q （Millipore， 18.2 MW·cm） 超纯水； 扫描光谱进行仪器自动校正.

1.4 高通量测序分析

本研究采用Illumina Hiseq 2500平台进行高通量测序， 以解析城市河道沉积物DOM对反硝化过程的微生物作用机制. 整个实验过程是委托上海美吉生物医药科技有限公司， 实验所用引物及序列如表1所示.

2 结果与讨论

2.1 城市河道沉积物DOM的赋存特征

从图1（a）三维荧光图谱中可以看出， DOM中出现了三类特征荧光峰， 分别是A峰 （405.4）、C峰 （2 210）和D峰 （2 480）. 其中， A、C峰主要用来反映外源输入的腐殖酸和富里酸， 其形成与腐殖质结构中的羟基和羧基有关[10-11]； D峰是类蛋白质荧光峰， 用来反映与生物降解性相关的色氨酸、酪氨酸所形成的荧光峰[12]. 图1（a）中A峰和C峰强度之和明显大于D峰， 说明城市河道DOM中主要包括腐殖酸和富里酸.

另外， 根据城市河道沉积物DOM的紫外-可见光谱（见图1（b））可知， 随着扫描波长（lWL）的增加， 吸光度呈现出先增加后降低的趋势， 河道沉积物DOM在220 nm附近出现明显的吸收峰， 吸光度（A）为3.08 cm–1. 有研究发现， 220 nm附近出现吸收峰的主要原因是DOM中含有苯环的p-p键跃迁，且峰强度与苯环等芳香结构含量有关[13]. 因此， 推测河道沉积物DOM中含有芳香族化合物. 此外， E3/E4 （A300/A400） 是300 nm和400 nm波长处的紫外吸光度之比， 常用来表示DOM的腐殖化程度、芳香性以及分子量分布等特征[14]. 周石磊等[15]研究表明， 当E3/E4 < 3.5时， 以腐殖酸为主； 当E3/E4 > 3.5时， 以富里酸为主. E3/E4值越大， 则DOM的腐殖化程度越低、芳香性越弱， 分子量也越小， 富里酸含量就越高[16]. 本研究中河道沉积物DOM的E3/E4值为6.54， 说明沉积物DOM的腐殖化程度较低， 芳香性弱， 以小分子的富里酸为主. 综合三维荧光图谱和紫外-可见光谱来看， 城市河道DOM中主要以小分子的富里酸为主.

2.2 DOM对反硝化过程的影响

模拟体系中TN、NO3–-N、NO2–-N及NH4+-N的动态变化如图2所示. 总的来讲， 所有实验组的NO3–-N浓度均呈现下降趋势， 并在18 d后趋于稳定， 稳定时浓度分别为 （17.31 ± 0.87） mg/L （空白组）、（7.40 ± 30.37） mg/L （DOM组） 及 （0.58 ± 0.03） mg/L （DOM协同乙酸盐组）. 与空白组相比， DOM组对TN和NO3–-N的去除率分别提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%， DOM协同乙酸盐组对TN和NO3–-N的去除效果更好， 分别可以达到39.83% ± 2.00%和46.03% ± 2.28%. 这些结果表明， DOM在一定程度上能够提高反硝化效果， 并且在乙酸盐的协同作用下体系的反硝化效果更强. 推测认为， 部分DOM可以直接作为反硝化过程的碳源， 加快了微生物对NO3–-N的利用， 进而促进了反硝化过程的发生； 乙酸盐的加入一方面可以直接作为反硝化过程的碳源， 另一方面也可以通过共代谢过程促进反硝化菌对DOM的利用， 从而促进反硝化过程. Bleyen等[17]也发现乙酸盐的存在不仅能显著提高微生物的还原活性， 还能作为辅助底物被微生物利用促进DOM降解.

另外， 所有实验组均出现了NO2–-N浓度先积累后降低的现象， 其中空白组NO2–-N积累量最多（（39.35 ± 1.97） mg/L）， 可能是由于空白组可利用碳源的不足发生了不完全反硝化导致NO2–-N的积累； 其次是DOM组 （（34.95 ± 1.75） mg/L） 和DOM协同乙酸盐组 （（21.04 ± 1.05） mg/L）， 表明DOM中存在难以被微生物利用的碳源， 部分可利用碳源促进了反硝化过程. 乙酸盐的加入不仅可以直接作为可利用的碳源参与反硝化过程， 而且可作为激发物质[18]刺激NO3–-N还原微生物对DOM中难降解组分的利用， 从而使NO2–-N快速被消耗. 值得一提的是， DOM体系中出现明显的NH4+-N浓度先快速增加而后降低并逐渐稳定的现象， 而且运行稳定后NH4+-N浓度维持在较高水平 （大于3.7 mg/L）， 推测认为， DOM会促进DNRA过程的发生， 从而导致了体系中NH4+-N浓度较高.

2.3 DOM对反硝化影响的微生物作用机制

2.3.1 细菌菌群结构特征

通过高通量测序分析发现， 变形菌门 （Proteobacteria）、拟杆菌门 （Bacteroidetes） 和绿弯菌门（Chloroflexi） 为各组的优势菌群， 其相对丰度分别为60.56% ～ 65.98%、11.04% ～ 18.46% 和1.09% ～10.57% （见图3）. 拟杆菌门是典型的反硝化菌门， 在硝酸盐的去除和木质素的降解中起着重要作用[19].与空白组相比， 含DOM体系的拟杆菌门的相对丰度明显增加， 由11.04%上升至13.19% ～ 18.46%，說明加入DOM有利于促进该类微生物的生长， 从而促进了反硝化作用. 绿弯菌门在DOM组的相对丰度较空白组有所增加， 从5.32%提升至9.44%. 该类微生物在氮循环中发挥着重要作用[20]， 而且还与溶解性碳水化合物的降解相关[21]. 但其在乙酸盐组的相对丰度仅有1.09%， 说明体系中加入乙酸盐可能对氮循环过程及溶解性碳水化合物的降解产生不利影响. 此外， 其他两组浮霉菌门 （Planctomycetes）的相对丰度均低于空白组， 该菌门主要参与厌氧氨氧化过程[22]， 推测DOM及乙酸盐协同DOM作用下会对该细菌的生长产生一定影响， 因而抑制了厌氧氨氧化作用.

不同组细菌在属水平下的相对丰度如图3（b）所示， 可以看出各组优势菌群的相对丰度存在差异.各组主要的优势反硝化菌属包括硫杆菌属 （Thiobacillus）、假单胞菌属 （Pseudomonas）、陶厄氏菌属（Thauera）、热单胞菌属 （Thermomonas） 和短波单胞菌属 （Brevundimonas）. 其中， 硫杆菌属和热单胞菌属为硫自养反硝化菌 （见表2）， 它们在DOM组的丰度高于其他组， 说明该体系中硫自养反硝化的活性较高， 推测DOM可以促进该种微生物的生长， 从而促进了反硝化作用. 与空白组相比， 含有DOM体系的假单胞菌属和短波单胞菌属的相对丰度明显增加， 推测投加DOM有利于该类微生物的生长. 有研究表明， 假单胞菌属可以利用DOM中较易氧化的官能团作为电子供体来促进自身的生长[17].而陶厄氏菌属在含DOM体系的相对丰度均低于空白组， 可能是陶厄氏菌属对有机物的竞争能力低于其他反硝化菌属.

另外， DOM组的ACE和Chao1指数最大， 分别为120 177.1和54 330.08， 其次是空白组 （分别为118 352.9和45 799.84） 和DOM协同乙酸盐组 （分别为36 565.59和16 829.54）， 说明DOM组的菌群丰富度最大， 而含有乙酸盐的体系菌群丰富度低于空白组. 根据Shannon指数， 可以发现， 微生物多样性是DOM组 （4.975 574） > 空白组 （4.762 311） > DOM协同乙酸盐组 （4.280 182）， 说明DOM能够促进体系中微生物多样性增加， 但在乙酸盐的协同作用下菌群的结构较为单一.

2.3.2 nirK型反硝化细菌菌群结构特征

nirK型基因是亚硝酸盐还原酶Nir的一种， 该基因编码的亚硝酸还原酶在反硝化过程中具有决定性的作用[29]. 各组nirK型反硝化细菌属水平相对丰度堆积图如图4所示. 副球菌属（Paracoccus） 是一种典型的异养反硝化菌属， 其在DOM组和DOM协同乙酸盐组的相对丰度均较空白组 （18.18%）高， 分别为31.82%和50.00%， 推测DOM可为nirK型反硝化微生物提供能源物质， 乙酸盐作为碳源也促进了该类微生物的生长. 亚硝化单胞菌属 （Nitrosomonas） 为主要的硝化功能菌[30]， 其在DOM组的相对丰度最高， 其次是空白组， DOM协同乙酸盐组中的相对丰度最低， 分析认为DOM有利于该类微生物的生长， 而DOM协同乙酸盐体系中会抑制该类微生物的生长.

2.3.3 DNRA功能菌群结构特征

DNRA细菌能够将沉积物中硝酸盐异化还原为氨氮， 被认为是底泥生态系统氮循环过程中不可忽视的重要过程， 对DNRA细菌多样性的研究常采用硝酸盐还原酶基因nrfA. 与DNRA功能相关的微生物在属水平的相对丰度如图5所示. 厌氧粘细菌 （Anaeromyxobacter） 是一种可以利用有机物还原硝酸盐的异养菌[31]， 其属于变形菌门 （Proteobacteria）. DOM组和DOM协同乙酸盐组中Anaeromyxobacter的相对丰度均较空白组有所增加， 从0.79%提升至5.06% ～ 6.19%， 推测DOM有利于刺激该类微生物的生长， 且乙酸盐协同作用下该类微生物增加得更多， 从而导致体系中氨氮增加.

3 结 论

本实验探究了城市河道沉积物DOM的赋存特征以及其对城市河道反硝化过程的影响作用. 城市河道沉积物DOM以小分子的富里酸为主要赋存形式， E3/E4值为6.54， 腐殖化程度较低、芳香性弱.由于DOM含有难以被微生物利用的碳源， 其对反硝化过程的促进作用相对较弱， 本实验条件下DOM对TN和NO3–-N去除率分别提升了7.24% ± 0.36%和23.52% ± 1.17%. 乙酸盐与DOM协同体系下的反硝化效果相对最优， 对TN和NO3–-N的去除率分别可以达到74.48% ± 1.29%和98.62% ±0.07%. 微生物的分析表明， DOM组中的硫自养反硝化菌属Thiobacillus和Thermomonas的相对丰度明显增加， 而DOM协同乙酸盐组中的异养反硝化菌属Pseudomonas和Brevundimonas及nirK型反硝化菌属Paracoccus的相对丰度明显提升. 此外， DOM组和DOM协同乙酸盐组中NH4+-N浓度均维持在较高的水平 （大于3.7 mg/L）， 而且二者体系中与DNRA功能相关的厌氧粘细菌 （Anaeromyxobacter）的相对丰度也均明显增加， 推测DOM在促进反硝化的同时诱导了DNRA过程的发生， 从而导致体系中NH4+-N浓度增加. 然而， DNRA过程的发生不利于城市河道氮素的削減. 建议通过适宜的曝气在泥水界面形成合理的好氧-缺氧微环境， 促进硝化-反硝化有效耦合作用， 强化氮的脱除.

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（责任编辑： 张 晶）