好氧反硝化菌的固定化及其效能研究

尹超 李莹 张婷月 刘佳敏 陈体达 崔丹 黄民生

摘要： 为了提高好氧反硝化菌的环境耐受性和脱氮效率， 采用聚乙烯醇（PVA）、海藻酸钠（SA）和稻壳粉作为载体对好氧反硝化菌进行固定化， 并对固定化颗粒的性能进行评价. 结果如下： 固定化颗粒最佳配比为12%聚乙烯醇（PVA）、8%海藻酸钠（SA）、0.5 g稻壳粉和10 mL菌液; 固定化颗粒具有较好的稳定性和传质性， 48 h的总氮（TN）去除率为89.35% ～ 90.12%. 固定化颗粒对pH值和转速具有良好的耐受性， pH值为11时， TN去除率为90%; 120 r/min时TN和NH4+-N去除率最高， 分别为91.29%和93.30%; 固定化颗粒不耐低温（10℃和15℃）， 在10℃时， TN去除率仅为20%左右; 但是在30℃时， TN去除率可达90.59%.

关键词： 好氧反硝化菌; 固定化; 脱氮

中图分类号： X522 文献标志码： A DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.001

Immobilization and efficacy of an aerobic denitrifier

YIN Chao1，2，3，4， LI Ying1，2，3，4， ZHANG Tingyue1，2，3，4， LIU Jiamin1，2，3，4， CHEN Tida1，2，3，4， CUI Dan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4

（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China; 3. Shanghai Engineering Rearch Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China; 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）

Abstract： To improve the environmental tolerance and nitrogen removal efficiency of an aerobic denitrifier， polyvinyl alcohol （PVA）， sodium alginate （SA）， and rice hull powder were used as immobilized carriers for an aerobic denitrifier and the performance was subsequently evaluated. The results showed that the optimal ratio of immobilized particles was a mixture of 12% PVA， 8% sodium alginate （SA）， 0.5 g rice hull powder， and 10 mL bacterial solution. The immobilized particles had strong stability and mass transfer capability; the removal efficiency of TN was 89.35% ～ 90.12% over 48h. The immobilized particles had good tolerance to pH and rotating speed. When the pH was 11， the removal efficiency of TN was 90%. The removal efficiency of TN and NH4+-N was the highest （91.29% and 93.30%， respectively） when the speed was 120 r/min. The immobilized particles were not resistant to low temperatures （10℃ and 15℃）， and the TN removal efficiency was only about 20% at 10℃. The TN removal efficiency， however， achieved 90.59% at 30℃.

Keywords： aerobic denitrifer; immobilization; denitrification

0 引 言

好氧反硝化菌因同時具有硝化-反硝化功能、环境适应性强等特点而逐渐成为处理氮污染水体的新生力量[1-4]. 但是实际工程中若直接利用好氧反硝化菌修复水体， 很可能会因为水量波动、雨水冲刷、噬菌体吞噬、有毒物质抑制等因素导致菌体流失、死亡， 使得水体的修复效果变差[5-6]. 研究表明，利用包埋固定化技术固定微生物能够提高微生物抗冲击能力、防止微生物流失、提高脱氮效率[7-9]. 例如， 将海藻酸钠（SA）与Klebsiella sp. FC61细菌混合固定， NH4+-N去除率由61.37%提高到72.15%[10];利用固定化技术包埋活性污泥后， NH4+-N去除率能达100%[11]. Zhou等[12]利用氧化石墨烯（GO）对聚乙烯醇（PVA）进行改性， 发现改性组的COD去除率比未改性组提高10%. 现阶段研究微生物固定化主要还集中于价格昂贵的材料， 大规模使用的可操作性仍值得商榷. 探索利用廉价添加剂（稻壳粉）作为固定化材料， 不仅降低固定化成本、提供碳源、增加孔隙率， 而且能有效解决农林废弃物的问题.

基于此， 本研究以前期筛选出的好氧反硝化菌群LHJ-1为研究对象， 探讨以PVA、SA和稻壳粉为主要固定化材料对好氧反硝化菌的脱氮性能进行提升; 并探究固定化材料的最佳配比及固定化颗粒对环境因子（转速、pH值、温度）的耐受性进行分析， 旨在为好氧反硝化菌固定化技术在实际氮超标的城镇污水的应用上提供一定的理论指导.

1 材料与方法

1.1 好氧反硝化菌及DTM培养基

好氧反硝化菌主要来自龙泓涧底泥的富集培养. DTM液体培养基由C4H4Na2O4 0.405 1 g/L、KNO3 1.000 0 g/L、KH2PO4 0.007 0 g/L、K2HPO4 0.027 0 g/L、MgSO4 0.005 0 g/L和微量元素溶液（2.000 0 mL/L）组成. 其中， 微量元素溶液组成由EDTA 100.0 mg/L、ZnSO4 4.4 mg/L、CaCl2 11.0 mg/L、MnCl2·7H2O 10.2 mg/L、FeSO4·7H2O 10.0 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 mg/L、CuSO4·5H2O 3.2 mg/L、CoCl2·6H2O 3.2 mg/L组成[13].

1.2 固定化颗粒制备

向含100 mL水烧杯中加入定量的PVA、SA、稻壳粉， 用无菌封口膜封住并置于水浴锅（85℃）中溶解. 待冷却至室温后加入定量菌液并缓慢搅拌， 避免产生气泡， 然后放入生化培养箱中培养4 h. 同时， 向饱和硼酸溶液中加入3%的CaCl2， 并调节pH值至6.5 ～ 7.0， 配制成交联剂. 培养4 h后用医用注射器将PVA-SA-稻壳粉混合液缓慢加入CaCl2-硼酸饱和溶液中， 并使用玻璃棒缓慢搅拌， 防止颗粒粘连， 交联4 h后转入0.5 mol/L的Na2SO4溶液中再交联1 h. 取出后用0.9% NaCl溶液冲洗， 放入冰箱中保存.

1.3 固定化颗粒性能评价

（1）稳定性： 向含100 mL蒸馏水的锥形瓶中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min（高速）、30℃摇床中培养48 h， 然后观察颗粒破裂情况.

（2）传质性能： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定OD600.

（3） TN去除率： 向高温灭菌的DTM液体培养基中加入30颗固定化颗粒， 于120 r/min、30℃摇床中培养48 h， 测定TN去除率.

1.4 固定化颗粒环境因子耐受性分析

向100 mL灭菌DTM液体培养基（以NH4Cl为唯一氮源， 碳氮比为8）中加入30颗固定化颗粒，并放入恒温摇床中进行培养. 实验中设置不同的摇床转速（0、30、60、90、120 r/min）、不同的实验温度（10、15、20、25、30℃）、不同的实验pH值（5、6、7、9、11）. 考察48 h后， TN、NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N的浓度变化、细菌生长情况和颗粒破裂情况， 进一步探究固定化颗粒对环境因子的耐受性.

1.5 实验指标分析

OD600由紫外分光光度法测定， TN采用碱式过硫酸钾消解紫外分光光度法， NH4+-N采用纳氏试剂法， NO3–-N采用紫外分光光度法， NO2–-N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定.

2 结果与讨论

2.1 固定化载体配比优化

为了确定固定化载体质量分数的范围， 首先进行了预实验（见表1）. 根据预实验结果， 最终设置参数： PVA 浓度为8%、9%、10%， SA浓度为0.4%、0.6%、0.8%， 稻壳粉为0 g、0.5 g、1 g， 菌液量为5 mL、10 mL、15 mL， 进行正交试验， 以TN去除率作为响应值. 固定化载体配比优化正交试验见表2，其中因素A为PVA（%），因素B为SA（%），因素C为稻壳粉（g），因素D为菌液（mL）. 由表3实验结果可知，， 最优配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液， TN去除率为79.02%.而根据极差结果显示当配比组合为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和5 mL的菌液时， TN去除率最高. 但是实际实验结果表明， 理论最佳配比组合的TN去除率为77.81%， 小于以TN去除率为基准的最佳配比组合. 因此， 实验最终以8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉和10 mL的菌液为最佳载体配比. 此外， 由极差（R）分析可知， 4个因素对TN去除率的贡献程度为稻壳粉 > PVA > SA >菌液， 说明碳源是好氧反硝化过程中最重要的影响因素.

2.2 固定化颗粒性能评价

2.2.1 稳定性评价

稳定性是固定化效果的重要评价指标之一. 固定化颗粒需具有一定的机械强度以抵抗外界环境的冲击， 保护體内微生物不被破坏， 维持较高的微生物浓度， 提高其重复利用率. 因此， 对固定化颗粒进行48 h的高速（120 r/min）机械强度实验， 通过肉眼观察结果表明， 实验组中30颗固定化颗粒的外观未出现破裂、变形现象. 通过游标卡尺测量颗粒平均直径发现， 实验前和实验后的30颗固定化颗粒平均直径并未发生明显增大现象. 用玻璃片夹住小球进行按压， 发现颗粒仍具有与新鲜颗粒相同的弹性. 综上所述， 固定化颗粒具有良好的稳定性和一定的机械强度.

2.2.2 传质性能评价

固定化颗粒的传质性能直接影响颗粒内外部的物质交换， 从而影响微生物活性和污染物的去除速率. 将颗粒和1 mL菌液分别接种于液体培养基中， 置于恒温摇床进行实验， 通过对比实验中OD600值的大小分析顆粒的传质性能. 48 h后测得颗粒组OD600值为0.121， 而游离菌组OD600值为0.116. 说明颗粒不仅具有良好的传质性能， 同时还能促进微生物的生长.

2.2.3 TN去除率评价

提高固定化颗粒的脱氮效率是对微生物进行固定化最重要的原因， 因此将颗粒移至液体DTM培养基中进行实验. 3组平行样中颗粒均未破裂， 且菌液OD600值分别为0.123、0.118、0.107， TN的去除率分别为90.59%、89.37%、88.16% （平均值为89.37%）， 比未固定化的游离菌脱氮效率（76.73%）高12.64%. 将上述3组颗粒再进行相同实验， 菌液OD600值分别为0.108、0.089、0.101， TN的去除率分别为91.08%、90.12%、89.35% （平均值为90.18%）， 比游离菌脱氮效率高13.45%. 以上实验说明， 固定化颗粒不仅具有良好的脱氮能力， 还具有重要的重复利用率， 具有很大的应用潜力.

2.3 固定化颗粒的环境因子耐受性分析

环境因子的变化不但能影响固定化颗粒物理性能（机械强度、传质性能等）， 而且能通过影响微生物的活性、浓度来影响好氧反硝化菌脱氮效率. 因此， 有必要研究不同环境因子（转速、温度、pH值）下固定化颗粒的耐受性， 通过分析微生物的生长、氮转化来评价固定化颗粒抗冲击性能和对微生物的保护能力.

2.3.1 转速耐受性分析

对于好氧反硝化菌来说， 溶解氧浓度直接影响好氧反硝化酶活性， 从而影响反硝化速率. 因此， 在实验中通过提高转速来增加液体培养基内溶解氧的浓度[14-16]. 提高转速还可以使微生物与培养基充分接触， 促进微生物的生长. 此外， 提高转速还会提高固定化颗粒之间的碰撞概率， 用以考察固定化颗粒的机械强度. 因此， 研究固定化颗粒在不同转速下的耐受性是十分必要的.

图1为不同转速对颗粒脱氮效果的影响。由图可知， TN去除率和NH4+-N去除率随着转速的增大而增大. 当转速为120 r/min时TN去除率和NH4+-N去除率最高， 分别为91.29%和93.30%. 但转速增大到150 r/min时， TN去除率略有下降. 这可能是因为： ①当转速较大时， 颗粒间碰撞机率增大，产生较大的摩擦力， 影响颗粒稳定性， 导致TN去除率降低; ②过快的转速会使细胞相互碰撞、破碎，细胞胞内氮溢出， 导致TN去除率下降. 此外， 实验中硝化作用不明显， NO3–-N和NO2–-N几乎没有积累. 当转速为0时， OD600值为0.003， 微生物几乎不生长. 当转速提高到60 r/min时， 菌液OD600值最大（0.134）， 可能是因为此时产生的溶解氧适合LHJ-1混合菌群中的兼性反硝化菌生长.

2.3.2 温度耐受性分析

微生物的新陈代谢速率是由体内的酶活性决定的， 而酶活性与外界的温度息息相关， 温度过低或者过高， 都会抑制酶活性[17-19]. 图2为不同温度对颗粒脱氮效果的影响。由图2可知， 随着温度的增大， TN和NH4+-N去除率也随之增大. 当温度小于20℃时， 细菌几乎不生长， TN去除率均在20%左右;硝化作用也不明显， NO3–-N和NO2–-N积累较少. 说明过低的温度会抑制微生物的酶活性. 当温度为25℃时， OD600值增长到0.098， TN和NH4+-N去除率分别达到77.40%和65.55%. 当温度为30℃时， TN和NH4+-N去除率分别可达90.59%和92.86%. 与游离菌相比， TN去除率提高约10%， 可能是固定颗粒中的稻壳粉为微生物生长提供了额外的碳源[13].

2.3.3 pH耐受性分析

图3为不同pH值对颗粒脱氮效果的影响。从图3可以看出， 当pH值为5时， 菌液OD600值最小0.003， 细菌几乎不生长， TN和NH4+-N去除率也低. 可能是因为过低的pH环境会导致微生物的核酸和表面蛋白发生水解， 影响微生物对营养物质的吸收， 抑制微生物新陈代谢[20-21]. 此外， 实验中观察到固定化颗粒发生自溶， 这会对微生物的保护作用减弱， 导致脱氮效率偏低. 当pH值为6时， 固定化菌群表现出较高的脱氮效率， TN和NH4+-N去除率分别为84.00%和85.55%; 说明微生物能够很好地利用外部营养物质进行生长繁殖， 也说明固定化载体对低pH环境起到缓冲作用. 当pH值超过7时， TN去除率随pH值增大而增大， 且均超过90%. 说明好氧反硝化菌对中碱性环境有较好的适应性且具有高效的脱氮性能[22]. pH值为7时， NO3–-N积累浓度为1.97 mg/L， 但是随着pH值增大， NO3–-N积累浓度不明显. 原因可能是硝化作用是一个产酸过程， 当溶液为弱碱性时， 能中和产生的H+， 加速硝化作用的进行.

3 结 论

利用交联法固定微生物不仅可以避免微生物流失， 还可以提高微生物的稳定性和处理效能， 但是交联材料价格昂贵、孔隙率低、传质性能低等缺点是其难以应用的主要原因. 本研究将农林废弃物与交联法结合， 不仅可以发挥传统固定化材料的优点， 还可以降低生产成本、提供碳源、提高材料孔隙率、提升微生物耐恶劣环境冲击能力等.

本文通过将PVA、SA、稻壳粉以及菌液进行优化配比作为好氧反硝化菌载体材料， 以期获得的固定化颗粒具有一定的稳定性、传质性和环境耐受性， 具体结果如下.

（1）利用正交试验分析可知， 实际最佳载体配比为8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻壳粉以及10 mL菌液， TN去除率为79.02%， 且固定化颗粒具有良好的稳定性、传质性和较高的脱氮效率.

（2）固定化颗粒的脱氮效率随转速和温度的增大而增大， 120 r/min时TN去除率达到最大（91.29%）; 固定化颗粒受温度影响较大， 随着温度的升高， 脱氮效率明显提高， 温度为30℃时， TN和NH4+-N去除率分别可达90.59%和92.86%. 此外， 固定化颗粒酸度耐受性提高， 当pH值为6时， TN和NH4+-N去除率分别为84.00%和85.55%. 因此， 固定化颗粒能够耐酸， 但是不耐低温. 此外， 溶解氧浓度也是影响其效率的因素之一.

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（責任编辑： 张 晶）