柠檬叶片溃疡病菌的分离鉴定及室内防治药剂筛选

李 亚，蔡永军，余沁涵，孔少连，周晓晴，张颖荷

（广东海洋大学滨海农业学院，广东湛江524088）

0 引言

柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)引起的一种重要检疫性病害，是柑橘生产上的重要病害之一[1]。柠檬作为一种营养兼药用价值较高的保健水果，近年来深受人们的喜爱，由于柑橘溃疡病的危害，粤西地区柠檬的产业发展和布局受到极大的限制。柑橘溃疡病菌因其菌系分化复杂、发病率高、传播途径广、传染速度快、寄主范围广对柑橘生产造成巨大损失[2]。该病害可危害芸香科数十种植物，包括橙类、柚类、柠檬等柑橘类品种，其中以甜橙、脐橙、酸橙等橙类品种最为感病[3]。感染柑橘溃疡病的柑橘枝条、叶片和果实表面形成类似火山口状的病斑，轻则影响柑橘树及柑橘的外观，引起少量的落果，重则能导致柑橘树大量落叶、落果甚至枝梢枯死，尤其是果实染病后，严重影响果实外观，极大降低了柑橘作为鲜食商品的价值[4]。目前对于柑橘溃疡病的防治主要以药剂防治为主，包括链霉素、四环素、中生菌、赤霉素和春雷霉素等农用抗生素[5]。对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的生防细菌，如枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等[6]。还有各种无机和有机铜制剂包括波尔多液、氢氧化铜、硫酸铜和噻菌铜等[7-8]。但是药剂的过多使用会增强溃疡病菌对各类防控药剂的耐药性[9]。因此，到目前为止还没有完全安全有效的方法对柑橘溃疡病进行彻底清除和防控，致使柑橘溃疡病逐渐向非疫区蔓延，危害不断扩大，严重影响了柑橘产业的健康发展[10]。为了深入研究柑橘溃疡病菌在柠檬上的发生发展规律和作用机制，详细调查研究湛江地区发展柠檬种植业的前景和风险。本文对柠檬叶片上疑似溃疡病病菌进行了分离鉴定，并在实验室条件下检测5种常用化学药剂对溃疡病菌的抑制效果，从而筛选出对柑橘溃疡病防治效果较好的防治药剂，为今后开展柑橘溃疡病菌的致病机制研究提供试验材料，也为柑橘溃疡病的田间防治和其它农药复配剂的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离和纯化

病原材料：采自湛江市果树所柠檬园柠檬溃疡病病叶。

病原菌的分离：取有典型柑橘溃疡病病斑的柠檬叶片，剪取病健交界处黄色晕圈部位小块病组织，用75%的乙醇处理30 s后，放入3%次氯酸钠中浸泡30 s，最后用无菌水冲洗3～5次，晾干后挑取3块约0.5×0.5mm的组织块放入加有500 μL无菌水的无菌研钵中研磨，随后转入1.5 mL尖底离心管中静置10 min。用接种环蘸取组织浸出液接种于NA固体培养基，28℃培养3天，挑取具有典型溃疡病菌黄色菌落特征的单菌落进行2～3次纯化后保存备用。实验在广东海洋大学滨海农业学院海洋微生物实验室，于2018年12月—2019年12月份进行。

1.2 病原菌的形态学观察

1.2.1 病原菌的菌落形态及鞭毛、荚膜观察 将纯化后的病原菌接种于NA培养基上，48 h后观察菌落特征。将纯化的病原菌在NA试管斜面上连续转接3次，取最新纯化的菌种放入28℃恒温箱中培养14 h，用接种环挑取沾有冷凝水的菌体5环，移入装有2 mL无菌水的离心管中，将其置于28℃恒温箱中静置10 min，待其幼龄菌鞭毛松展开，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，并将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，涂片放空气中自然干燥，用电子显微镜观察荚膜和鞭毛的形态[11]。

1.2.2 病原菌的革兰氏染色 参照革兰氏染色试剂盒（环凯微生物革兰氏染色液配套试剂，广东环凯微生物科技有限公司）说明书对其进行革兰氏染色并观察。

1.3 病原菌的分子生物学鉴定

1.3.1 病原菌基因组DNA提取 将分离纯化后的溃疡病菌接种到LB液体培养基中，28℃，200 r/min摇48 h后，取1.5 mL菌液提取其DNA（方法参考TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）用于后续PCR鉴定。

1.3.2 病原菌的PCR鉴定 以提取的病原菌DNA为模板，分别用柑橘溃疡病菌的特异性引物P8/P9[12]、JYF5/JYR5[13]、Xac01/Xac02[14-15]、GGS1F/GGS2R[16]及 27F/1492R(16S rDNA)进行PCR扩增，所用引物序列（见表1）。PCR扩增反应体系为25 μL，反应条件为96℃，5 min；95℃，45 s，55℃，30 s，72℃，60 s；35个循环，72℃，7 min。PCR完成后取5 μL产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电压120 V，电泳25 min，凝胶成像系统观察目的条带。将目的条带的PCR产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

表1 柑橘溃疡病菌分子鉴定的特异性引物

1.4 病原菌的致病性测定

将纯化的病原菌在NA培养基上28℃培养48 h后，用无菌水稀释菌悬液浓度至1×108cfu/mL[17]。选取健康柠檬叶片，采用离体叶片接种法对病原菌的致病性进行测定，将蘸取菌液后的灭菌脱脂棉覆盖在叶片的针刺部位，以无菌水作为对照，每个处理3次重复。将接种后的离体叶片置于28℃、湿度为60%、光照时间为12 h的培养箱中，2天后将覆盖叶片的脱脂棉去除，叶片继续保持28℃光照保湿培养，每天观察并记录发病情况。根据柯赫氏法则对回接发病的柠檬叶进行病原菌的再分离、纯化与鉴定，并与最初的接种菌进行比较。

1.5 病原菌的生理生化测定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]，对病原菌的不同碳源利用等各项生理生化进行鉴定。包括D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、蔗糖、蜜二糖、海藻糖、丙三醇、肌醇、核糖醇、山梨醇、D-甘露醇等的分解代谢情况，并对其淀粉水解实验、过氧化氢酶测定、氧化酶测定、明胶液化能力、甲基红实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验、产氨实验、V-P测定实验等各项生理生化指标进行测定。

1.6 室内药剂筛选

1.6.1 供试药剂 46%氢氧化铜水分散粒剂（美国杜邦公司）、27.12%碱式硫酸铜悬浮剂（澳大利亚纽发姆有限公司）、12%中生菌素可湿性粉剂（福建凯立生物制品有限公司）、50%氯溴异氰尿酸可溶性粉剂（江苏克胜集团股份有限公司）、10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂[撒尔夫（河南）农化有限公司]。

1.6.2 毒力测定方法 将病原菌在NA固体培养基上活化后，转接NB液体培养基28℃振荡培养24 h[19]。将菌液稀释成1×108cfu/mL，取1 mL菌液，连同冷却至40～50℃的NA固体培养基10～15 mL，一起倒入灭菌培养皿中，摇匀后冷却凝固并做好标记。用灭菌的镊子夹取消毒的滤纸片(d=1.5 cm)分别投入各种待测药液中，30 min后把药液的滤纸片放置于固体培养基中心位置（以水作为对照），每皿3～4片，在皿底做标记，每个处理重复3次，28℃培养48 h后用十字交叉法测量其抑菌圈直径，重复3次取其平均值，并按公式(1)计算抑制百分率。

其中A：抑制百分率，B：抑菌圈直径，C：纸碟直径。

根据菌抑制率与其所对应的杀菌剂浓度，计算杀菌剂对柑橘溃疡病菌的抑制有效中浓度，即为EC50[20]。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离和纯化

从湛江市果树所采集的新鲜柠檬病叶（图1），病斑部位正反面隆起，初期呈海绵状，感染后期病部中央破裂逐渐形成木栓化并开裂呈火山口状，病斑周边有黄色晕环。采用稀释分离法分离病原菌后（图2），挑取具有典型溃疡病菌菌落特征的单菌落进行纯化并保存。病原菌在NA培养基上培养3天后，菌落呈蜡黄色，圆形，全缘，表面光滑，有光泽，微隆起，粘稠状（图3），将纯化保存的病原菌编号为zlm1908。

图1 健康柠檬叶片与感病柠檬叶片

图2 病原菌的分离

图3 病原菌的菌落形态

2.2 病原菌的形态学观察

2.2.1 鞭毛及荚膜观察 通过电子显微镜观察，病原菌zlm1908的菌体呈短杆状，两端钝圆，极生单鞭毛，能游动，有荚膜，无芽孢（图4）。

图4 柑橘溃疡病菌的鞭毛及荚膜电镜观察

2.2.2 革兰氏染色 病原菌zlm1908染色后用100倍油镜观察发现该病原菌呈红色，为革兰氏阴性菌（图5）。

图5 柑橘溃疡病菌的革兰氏染色

2.3 病原菌的分子生物学鉴定

利用柑橘溃疡病菌的特异性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和 GGS1F/GGS2R以 及 细 菌16SrDNA通用引物27F/1492R检测所分离到的病原菌的DNA，分别得到符合预期大小的870 bp，413 bp，582 bp，760 bp和1500 bp的目的条带（图6）。将PCR产物测序后得到的序列与Genbank中的序列进行比对分析，结果显示分离物zlm1908的引物P8/P9扩增的序列与strainXcc49相似性为99.08%，strainXcc49的登录号为(CP023662.1)。Xac01/Xac02扩增的序列与strainXcc49相似性为99.04%，strainXcc49的登录号为(CP024031.1)。结合5对不同引物PCR扩增结果表明所分离的病原菌为柑橘溃疡病菌(Xcc)。

图6 特异性引物的PCR扩增结果

2.4 病原菌的致病性测定

柠檬叶片回接病原菌4～5天左右，刺伤部位正反面均出现海绵状隆起，接种点周围出现轻微黄色晕圈。7～9天后叶片海绵状逐渐形成木栓化，叶片接种点周围黄色晕圈更为明显。2周后叶片上接种点周围形成典型火山口状病斑，且叶背面更为明显，对照组不发病（图7A,B）。通过柯赫氏法则从接种发病病斑中重新分离病原菌，挑取与黄单胞形态相似的菌落进行纯化后得到与接种菌菌落形态极为相似的病原菌(图7C,D)。利用柑橘溃疡病菌的4对特异性引物P8/P9、JYF5/JYR5、Xac01/Xac02和GGS1F/GGS2R对分离纯化后的接种菌进行菌落PCR鉴定，分别得到413 bp、582 bp、760 bp和870 bp与最初接种菌完全一致的特异性目的条带，因此可以确定从离体叶片发病部位分离出的病原菌与接种的柑橘溃疡病菌一致。

图7 病原菌体外致病性测定及接种菌的再分离

2.5 生理生化测定

将分离鉴定的柠檬溃疡病菌菌株zlm1908与对照菌株生理生化结果表明：该病原菌可以利用D-果糖、蜜二糖，不能以D-半乳糖、D-甘露糖、海藻糖、蔗糖、丙三醇、核糖醇、D-甘露醇、肌醇、山梨醇等作为碳源（表2），淀粉酶（阳性）、过氧化氢酶（阳性）、明胶液化（阳性）、硝酸盐还原（阳性）、产氨（阳性）、氧化酶（阴性）、吲哚（阴性）、V-P（阴性）、甲基红（阴性）（表2）。

表2 病原菌zlm1908生理指标测定

表3 病原菌zlm1908生化指标测定

2.6 供试药剂的室内毒力测定结果

室内毒力测定结果表明供试的5种药剂对柠檬溃疡病菌zlm1908都有一定的抑制效果（表4）。枯草芽孢杆菌在低浓度时就显示出较好的抑菌效果，当浓度为15 g/L时，抑制率可达到59.5%，当浓度增加到40 g/L时，抑菌率达到68%。46%氢氧化铜的抑菌效果与有效浓度密切相关，有效浓度越高，抑菌效果越好，当有效浓度从16 g/L增加到60 g/L，抑制率从46.9%上升到79.1%。27.12%碱式硫酸铜的抑菌效果，从有效浓度为5 g/L上升到40 g/L时，抑菌率从34.8%上升到64.3%。50%氯溴异氰尿酸对该菌的抑制效果也不错，当有效浓度为45 g/L时，抑菌率可达到55.9%。12%中生菌素有效浓度为25 g/L时，抑菌率就已经达到的54.1%，但在25～60 g/L时，抑制率变化较为平缓，保持在54.1%～60.5%之间。

表4 5种杀菌剂对病原菌zlm1908的室内毒力测定

2.7 供试药剂对柑橘溃疡病菌的毒力回归方程

由供试药剂对柠檬溃疡病菌的毒力回归方程可知（表5），供试药剂浓度的对数值与抑制率的机率值间有良好的线性关系，除50%氯溴异氰尿酸PX的R2为0.97，其他4种药剂的R2都在0.99以上。46%氢氧化铜WG、27.12%碱式硫酸铜SC、枯草芽孢杆菌WP、50%氯溴异氰尿酸PX、12%中生菌素WP的EC50值分别为18.45 g/L、14.99 g/L、5.28 g/L、32.81 g/L和14.60 g/L，从EC50的大小可以看出5种杀菌剂的毒力作用的强弱依次为：10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP＞12%中生菌素WP＞27.12%碱式硫酸铜SC＞46%氢氧化铜WG＞50%氯溴异氰尿酸PX。

表5 5种杀菌剂对病原菌zlm1908的毒力回归方程

3 讨论

柠檬属柑橘类水果，具有独特的风味，富含多种维生素、类胡萝卜素、类黄酮等生物活性成分，有生津解暑、助消化、预防心血管硬化、预防口腔溃疡、缓解疲劳及美容养颜等多种功效，除直接鲜食和切片泡水外，柠檬还广泛用于制作饮料、提取精油和入药等，是药食兼用的功能性水果，深受消费者喜爱[21]。由于柑橘溃疡病的危害，柠檬的产业发展和布局受到很大的限制，为了深入研究溃疡病菌在柠檬上的发生发展规律和作用机制，详细调查研究湛江地区大力发展柠檬种植业的前景和风险，本文对柠檬叶片上疑似溃疡病病菌进行了分离鉴定和室内防治药剂筛选。本试验证实在所有的供试药剂中，产自撒尔夫（河南）农化有限公司的10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对柑橘溃疡病菌的室内毒力作用最强，最高抑制率可达68%。吴明琼等[22]在筛选柑橘溃疡病菌拮抗细菌试验中发现，解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对溃疡病菌都有较好的抑菌效果。Caicedo等[23]认为枯草芽孢在植物体内抑制柑橘溃疡病菌的毒力作用可能与细菌附着及生物膜形成的改变有关。芽孢杆菌作为最有应用前景的生防细菌，在黄瓜棒孢叶斑病、辣椒疫病、香蕉枯萎病等很多植物病害的防治中表现出良好的抑菌效果[24-26]。关于枯草芽孢杆菌的抑菌机制可能与该菌能在植物体内及植物生长的土壤中快速、大量繁衍和定植，并通过营养竞争和空间位点竞争有效地阻止病原微生物的繁殖，干扰植物病原微生物对植物侵染，破坏病原微生物在植物上的定殖，从而达到良好抑菌效果[27]。随着人们对农产品质量和品质要求的不断提高，芽孢杆菌将在农药领域中发挥着重要作用，未来将在柑橘溃疡病和其他病害生物防治及农药的安全使用和环境保护方面有着良好的应用前景。

农用抗生素及其衍生物也是生产上用来进行柑橘溃疡病防治的主要药剂，主要包括链霉素、硫酸链霉素、中生菌素、土霉素、四环素等。不同农用抗生素对柑桔溃疡病的防治效果因使用地域不同，浓度不同、药品生产厂家不同等差别较大，尤华峰等[5]进行室内毒力测定发现72%农用链霉素WP对柑橘溃疡病菌没抑制活性，但普通的生物试剂链霉素、四环素稀释32000倍以后持续抑菌期超过14天。任建国等[28]发现来自重庆成都3个不同厂家的72%农用链霉素WP均无抑菌效果，但购于圣丰化学（河南）有限公司的溃枯宁（有效成分10%农用链霉素）1000倍稀释液对溃疡病菌有较强的抑制效果。钟德志等[29]在浙江使用72%农用链霉素WP发现抑菌效果非常明显。除了链霉素外，其他农用抗生素如0.3%的四霉素AS，3%中生菌素可湿性粉剂室内测定结果显示都对柑桔溃疡病菌有非常强的抑制效果[30]。本实验结果也证实12%中生菌素WP防治效果仅次于枯草芽孢杆菌，防治效率最高达60.5%。

铜制剂如碱式硫酸铜和氢氧化铜等因其具有粘附性好、毒性低等特点，也经常作为药物来抑制各类植物病原菌。有研究表明，金属离子可作为细菌蛋白的辅基或辅助因子参与黄单胞杆菌的代谢过程，从而影响该病原菌对寄主的致病性[31-32]。Heydarpanah等[33]采用离体防治和活体接种两种方法研究了波尔多混合物、三氯氧化铜和硫酸铜等3种铜制剂对柑橘溃疡病菌的抑制作用，结果发现波尔多混合物在柑橘溃疡病的防控方面表现出很好的抑菌效果。Behlau等[34]通过不同时段喷洒不同的铜制剂探究其对Xcc的功效发现，在不同时间，铜对柑橘溃疡病的影响有所差异，但总体上，柑橘溃疡病在叶片上的发病率与铜喷雾的总量呈线性反比关系。在选用27.12%碱式硫酸铜SC、77%硫酸铜钙WP、20%噻菌铜SC与47%春雷.王铜WP这4种药剂对海南琼中绿橙溃疡病进行田间药效对比试验中发现供试的4种药剂对溃疡病菌的防治效果均高于70%，且春雷.王铜因具有保护和治疗双重作用，其防效优于碱式硫酸铜，因此可在生产上推广应用[35]。结合本试验毒力测定试验结果表明27.12%碱式硫酸铜SC和46%氢氧化铜WG最高防效分别可以达到79.1%和64.3%，甚至超过枯草芽孢杆菌的最高防治效率，说明铜制剂确实对柑橘溃疡病菌株有良好的抑制效果，可作为防控柑橘溃疡病的有效药剂。至于不同的铜制剂以及不同实验中相同的铜制剂表现出的防治效率的差异可能跟与菌株的致病性、菌株所处的环境、试验条件、或农药生产厂家及农药制作工艺等不同有关。氯溴异氰尿酸在植物表面释放的酸类物质对病原菌有一定的抑制作用且对植物和环境危害较小，因此该类药剂可以用在病害初期来预防和控制柑橘溃疡病。据报道，在选用50%氯溴异氰尿酸防治柑橘溃疡病时发现该药剂对溃疡病菌有良好的防控作用，其防效最高可达66.6%[36]。本试验在选用50%氯溴异氰尿酸抑制溃疡病菌的试验中发现，该药剂虽然是所选5种药剂中抑制效果最弱的，但最高的防治效率仍然可以达到55.9%。

4 结论

实验结果表明从疑似柑橘溃疡病病斑的柠檬病叶上所分离到的菌株zlm1908，通过对其形态学观察、生理生化指标测定和分子生物学鉴定其为柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xcc)，是引起湛江地区柠檬上产生柑橘溃疡病病斑的病原菌。室内毒力测定结果表明供试的5种药剂对柠檬溃疡病菌zlm1908都有一定的抑制效果，从EC50的大小可以看出5种杀菌剂的毒力作用的强弱依次为：10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP，12%中生菌素WP，27.12%碱式硫酸铜SC，46%氢氧化铜WG和50%氯溴异氰尿酸PX。由此可见不同的化学药剂在一定程度上对柑橘溃疡病菌都有一定的抑制效果，但无论是生防菌、抗生素还是化学药剂在室内毒力测定中EC50都相当高，最高防治效率除50%氯溴异氰尿酸外均超过60%。但实验过程中也发现供试药剂的防治效率都跟药品的使用浓度呈正相关，当供试药剂的浓度设置较低时，对柑橘溃疡病菌菌株zlm1908的抑制效果不明显，因此推测在田间试验中，在环境条件要求的浓度范围内使用时，这5种药剂对柑橘溃疡病的实际防治效果应该不理想。虽然室内毒力测定结果可以直接为田间用药提供理论参考，但是室内毒力测定毕竟是离体情况下测定杀菌剂对柑橘溃疡病菌的抑制作用，不能等同于大田实际防治效果，大田使用时会因为病原菌浓度差异、寄主植物的作用、田间气候、药剂的附着及渗透力等因素而表现出与室内不同的作用效果，因此这5种药剂在田间对柑橘溃疡病的防治效果，还需要通过进一步的田间实验来证实。