HPLC-FLD法测定不同产地林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量

刘芳馨，王月洁，许佳明，李季泽，赵寰宇，徐阳，鲍慧玮*（.长春中医药大学药学院，长春307；.白城医学高等专科学校药学系，吉林 白城 37000）

中国林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）是一种广泛分布于中国东北的两栖动物[1]，是我国传统名贵补品，最早记载于《饮片新参》[2-3]，性凉、味咸、入肺肾经，具有养肺滋肾的功效。中国林蛙中雌蛙输卵管干燥后取其脂肪状物即为林蛙油，去油后残留大量副产物，如林蛙卵等。林蛙卵和林蛙油中含有丰富的蛋白质、维生素、脂肪酸等营养成分[4-6]，具有降血脂、抑制血小板聚集、抗自由基等作用，林蛙油被称为“软白金”“林中之宝”“动物人参”“北方燕窝”[7-9]。

雌二醇（estradiol，E2，结构见图1）是林蛙卵和林蛙油中最具代表性的甾体类激素[10]，它可以缓解因为年龄增长、机体功能下降而导致的雌激素分泌不足[11-12]，此外，雌激素还能影响机体的代谢、促进子宫的蛋白质合成等[13]。由于雌二醇具有荧光吸收特性，因此本文建立HPLC-FLD法测定不同产地林蛙卵和油中雌二醇的含量，为林蛙卵和林蛙油的安全食用、产品研发提供参考。

图1 雌二醇化学结构式Fig 1 Chemical structure of estradiol

1 材料

1.1 试药

东北地区林蛙油和林蛙卵，从各中药材市场购买，由长春中医药大学中药鉴定教研室肖井雷副教授鉴定为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensisDavid 雌蛙的干燥输卵管和卵，来源见表1。雌二醇对照品（批号：100182-201205，含量以98%计，中国食品药品检定研究院）。

甲醇[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；磷酸（分析纯，北京化工厂）；纯净水（杭州娃哈哈股份有限公司）。

1.2 仪器

Agilent LC1100 高效液相色谱仪，配备FLD检测器（美国安捷伦公司）；鼎力DFY-500（摇摆式）多功能高速中药粉碎机（温州顶力医疗器械有限公司）；DHG-9123A 型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-250 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（55∶45，V/V）；流速1.0 mL·min－1；柱温为40℃；荧光检测器激发波长为282 nm，发射波长为315 nm；进样量为20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取雌二醇对照品5.42 mg，加甲醇超声溶解并稀释至250 mL 量瓶，摇匀，备用；精密吸取1 mL，加甲醇稀释至10 mL，制得2.168 μg·mL－1雌二醇的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取干燥的林蛙油和林蛙卵样品，粉碎，过100 目筛，称取粉末约2 g，加入20 mL 甲醇超声（250 W，40 kHz）提取30 min，过滤，重复操作2 次，合并滤液后60 ℃旋转浓缩至5 mL，制得林蛙油和林蛙卵供试品溶液。

2.4 系统适应性试验

将雌二醇对照品溶液、林蛙油和林蛙卵供试品溶液按照“2.1”项下色谱条件进行分析，得到色谱图见图2。其中，在与对照品溶液色谱图相应的位置上，供试品溶液有相同保留时间的色谱峰，而且待测成分色谱峰与相邻色谱峰均分离完全，理论塔板数以雌二醇计算均大于3000。

图2 林蛙油和林蛙卵的HPLC-FLD 色谱图Fig 2 HPLC-FLD chromatogram of oil and eggs of Rana Dybowskii

2.5 方法学试验

2.5.1 线性关系考察 分别精密移取“2.2”项下雌二醇对照品溶液0.1、0.5、1、2.5、5、10 mL，加甲醇至10 mL，制得6 个不同质量浓度的雌二醇对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样分析。以雌二醇浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到回归方程为Y＝523.6X－61.66（r＝0.9999），表明雌二醇质量浓度在0.22 ～21.68 μg·mL－1与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.2 精密度试验 将雌二醇对照品溶液按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，记录色谱峰面积。计算雌二醇色谱峰面积的RSD值为0.67%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 将林蛙卵供试品溶液室温放置，分别于0、2、4、6、8、12 h 时按照“2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱峰面积。计算雌二醇色谱峰面积的RSD值为1.5%，表明林蛙卵供试品溶液在12 h 内具有良好的稳定性。

2.5.4 重复性试验 取批号为JY20180901 的林蛙卵样品，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。计算雌二醇的平均含量为7.058 μg·g－1，RSD值为1.7%，表明该方法具有良好的重复性。

2.5.5 加样回收试验 取批号为JY20180901 的林蛙卵样品6 份，粉碎，每份约1 g，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入质量浓度为7.12 μg·mL－1的雌二醇对照品溶液1 mL，再按照“2.3”项下方法制备，在“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。计算雌二醇的平均加样回收率为100.4%，RSD值为1.4%，表明该方法具有良好的准确度。

2.6 样品含量测定

称取9 个批次的林蛙卵和林蛙油样品各约2 g，分别制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，结果见表1。

表1 林蛙中雌二醇含量(μg·g－1，n ＝3)Tab 1 Estradiol content in Rana Dybowskii (μg·g－1，n ＝3)

3 讨论

林蛙卵和林蛙油中主要含有的激素类成分为乙酸雄甾酮、前列腺素、美屈孕酮、雌二醇等，其中雌二醇含量较高[10]，且具有良好的药效作用。本文建立HPLC-FLD 法测定林蛙卵和林蛙油中雌二醇的含量，并对不同产地9 批林蛙卵和林蛙油样品进行测定，发现不同批次样品中雌二醇含量差异比较大，且总体雌二醇含量较低。虽然动物药的差异性较大，但是建立的含量测定方法仍可快速、稳定地检测出雌二醇的含量，可作为监控林蛙卵和林蛙油中雌激素水平及评价林蛙卵和林蛙油质量的依据。

本试验曾考察了色谱柱型号（Extend C18色谱柱、Alltima C18色谱柱、Agilent TC C18色谱柱），流动相体系（甲醇-水、乙腈-水），色谱柱温度（30、35、40、45℃）和流速（1.0、1.5、2.0 mL·min－1）对雌二醇色谱峰分离度、峰形、出峰时间的影响[14-16]，结果采用本研究色谱条件时得到的色谱峰峰形最佳，与相邻色谱峰分离最完全，且出峰时间适中，适合作为林蛙卵和林蛙油中雌二醇检测的色谱条件。

在检测器和检测波长选择时，对比了荧光检测器和紫外检测器，紫外检测器较为常用，但是对于一些具有荧光的物质，荧光检测器的灵敏度更高，更适用于一些较低含量的荧光物质，故本试验选择荧光检测器测定林蛙油和林蛙卵中含量较低的雌二醇。采用HPLC-FLD 法测定雌二醇，并对激发波长和发射波长进行筛选，最终发现荧光检测器激发波长为282 nm，发射波长为315 nm，测定效果较好，雌二醇色谱峰有较高吸收，与附近色谱峰分离较好。

在供试品提取方法选择时，分别考察超声提取法、回流提取法、浸渍提取法，其中超声提取法和回流提取法提取效果最佳，而超声提取法在提取效率方面更具优势。随后考察不同提取溶剂，例如甲醇、95%乙醇、无水乙醇等，最终发现甲醇提取效果最佳，干扰较少。