基于SSR的四川榛子资源亲缘关系研究

王泽亮, 吴斌, 邢文曦, 郑崇文, 李丕军

四川省林业科学研究院, 四川 成都 610081

榛属（CorylusL.）植物，为落叶小乔木或灌木，较少为乔木，约有20余种，分布于亚洲、欧洲与北美洲。我国有10个种（变种），主要原生分布在西南地区与东北、华北、西北三北地区[1]。榛属植物种子不但含油丰富，还富含蛋白质、维生素及矿物质元素，为世界“四大坚果”之一，可直接食用，在巧克力、糖果、奶制品及焙烤食品产业中也广泛应用，具有较高的经济价值[2]。我国辽宁省经济林研究所等单位自20世纪60—80年代先后开展了欧榛引种、平榛选育以及平榛与欧榛的杂交育种研究，并于1999年开始选育出了一系列平欧杂交榛子良种，目前已在三北地区与山东、安徽等地推广，填补了国内榛子栽培品种的空白，开启了我国榛子园艺化栽培与产业发展的新时代[2-3]。

四川是榛属植物资源的重要分布区，尽管不同文献记述稍有差异，但国内榛子资源至少有7种在本区域有分布，包括滇榛、川榛、刺榛、毛榛、藏刺榛（C.feroxvar.thibetica）、华榛（C.chinensis）、披针叶榛（C.fargesii）[1]，主要分布在阿坝州、凉山州、甘孜州及秦巴山区等地，目前国内外仅有少量研究将川榛、滇榛作为试验材料的一部分[4-6]。为了有效的利用这些野生榛子资源，首先需要深入了解其分布状况及遗传基础。

简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）分子标记在植物中分布广泛、多态性丰富，且具有共显性、表现稳定等特点，已成为植物群体遗传多样性与遗传结构等研究的有效手段，持续推动了遗传改良进程[7-10]。在榛属植物研究中，美国俄勒冈州立大学Mehlenbacher实验室首先开发出了专用的SSR分子标记[11]，目前已广泛应用于榛子遗传多样性、遗传结构分析及遗传图谱构建、亲缘关系研究等方面[12-14]，有效推动了榛子资源的培育与利用研究。

本研究使用前期筛选的9对引物[15]分析了目前收集到的川榛、滇榛、刺榛、毛榛、欧榛资源的亲缘关系，以利于下一步杂交育种亲本的选择，并期望最终推动四川榛子资源的良种选育与保护利用。

1 材料与方法

1.1 材料

选择54份榛子资源参与本项目研究，具体信息见表1，其中欧榛为国外引进资源。采集新鲜叶片，使用变色硅胶干燥，并保存于-80℃冰箱备用。

表1 参试的榛子种质资源Tab.1 General information of the test hazelnut germplasm resources

1.2 方法

利用9对SSR引物对样品进行分型分析，引物信息、基因组DNA提取、PCR扩增体系、程序与SSR产物电泳分型桐以前研究[15]。遗传参数采用GenAlEx6.51b2软件计算[16]，个体Nei’s遗传距离利用NTSYS-pc 2.10s计算、并进行UPGMA聚类分析[17]，利用计算的参数对参试榛子群体遗传多样性与亲缘关系进行解析。

2 结果与分析

2.1 榛子资源遗传多样性与遗传结构

本文使用SSR分子标记技术对54份榛子资源进行了遗传多样性分析，SSR位点遗传参数见表2。其中，等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon's信息指数（I）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）分别介于2.455~5.000、1.877~4.083、0.667~1.461、0.445~0.818、0.381~0.732之间。平均每个位点扩增出3.596个等位基因，Ch07检测到的平均等位基因数最多、为5.000，Ch03检测到的最少、为2.455。平均有效等位基因数为2.772，其中最多的位点是Ch07、为4.083，而Ch08最少、为1.877。

有效等位基因数、杂合度与Shannon’s信息指数反映了群体等位基因分布的丰富与均匀程度[18]。本研究中，11个群体的有效等位基因数介于2.030~3.427之间、均值，观察杂合度范围介于0.467~0.756，期望杂合度变动于0.396~0.678，Shannon’s信息指数范围为0.680~1.296，4个参数的均值分别为2.772、0.644、0.546、1.016（见表2）。基于上述数据，参试的11个榛子群体的遗传多样性处于中等水平，且11个群体中茂县川榛（C）与泸定滇榛（B）群体多样性水平较高，而盐源滇榛（E）与茂县毛榛（O）群体遗传多样性水平较低。

表2 总群体 SSR 遗传参数Tab.2 SSR genetic parameters of total populations

遗传分化系数（Fst）是衡量群体间分化程度的指标，根据Fst值（见表2），参试群体31.7%的遗传变异存在于群体间、68.3%存在于群体内，说明群体间、群体内的变异均是榛子总群体遗传变异的来源。同时Fst>0.25表示群体间的遗传分化很大[19-20]，因此本文认为参试榛子总群体间的遗传分化很大，与遗传分化很大相一致，群体间的平均基因流值（Nm）仅为0.646，这也与参试材料包括滇榛、川榛、毛榛、刺榛、欧榛相一致。

同时从各群体来说，观察杂合度均高于期望杂合度（见表3），表明参试的各榛子群体杂合子过剩，群体内有较高的基因交流。

表3 群体遗传参数Tab.3 Genetic diversity of the test populations

2.2 榛子资源亲缘关系

基于参试个体的遗传距离，分别进行了Population assignment（见图1）分析与主坐标（PCoA）分析（见图2）。 Population assignment分 析 则 显 示 刺榛、毛榛与欧榛为1类，川榛与滇榛为1类。主坐标分析显示榛子资源分为刺榛、毛榛与欧榛、川榛与滇榛3类。说明毛榛与欧榛的亲缘关系较近，川榛与滇榛的亲缘关系也较近。

图1 群体分配分析Fig.1 Population assignment analysis

图2 主坐标分析Fig.2 Principal coordinate analysis

进一步利用个体Nei’s遗传距离构建UPGMA聚类图（见图3），结果显示相关系数为 0.31时，54个榛子种质资源个体可聚类为毛榛、欧榛、刺榛、川榛与滇榛4类。而且从聚类图上可以看出毛榛与欧榛的亲缘关系较近，川榛与滇榛的亲缘关系也较近，与主坐标分析结果相似，也与王艳梅的结果相一致[4]。

图3 基于 Nei’s 遗传距离的 UPGMA 聚类分析Fig.3 UPGMA clustering analysis based on Nei's genetic distance

3 讨论

本研究使用9个SSR分子标记分析了四川不同县域的川榛、滇榛、刺榛、毛榛与引进的欧榛资源的群体遗传多样性与亲缘关系，结果显示参试的榛子群体的遗传多样性处于中等水平，且川榛与滇榛的亲缘关系较近，毛榛与欧榛的亲缘关系也较近。

一般来说，在较近的地理区域内，由于环境与气候条件比较接近，自然选择压力趋于一致，在一定程度上增加了种间的基因交流，因此地理较近的种遗传相似性较大、亲缘关系较近。川榛与滇榛的亲缘关系较近也说明了这一点，川榛主要分布于阿坝州，滇榛主要分布于凉山州，而且根据文献资料与我们的调查，川榛与滇榛在凉山冕宁、甘孜泸定均有分布。而毛榛与欧榛地理距离远、亲缘关系较近，川榛与毛榛（参试资源分布于茂县）、刺榛与滇榛（冕宁均有分布）亲缘关系相对较远，可能跟其进化历史有关。Bassil等通过研究认为：亚洲在冰期是榛属植物的避难地，随后其通过地中海扩散到欧洲，通过大西洋陆桥与（或）白令陆桥扩散到北美洲[21]，与桦木科桤木属植物系统发育相一致[22]。因此，我们推测在进化历史上毛榛与欧榛可能有较近的共同祖先，而川榛与毛榛、刺榛与滇榛尽管目前地理距离较近，然而进化历史上却来自不同的分支。当然，这种推测需要进一步的研究来证实。对于杂交育种，从本文研究结果来说，川榛与滇榛、毛榛与欧榛可能比较容易得到杂交子代，当然这也需要下一步的试验结果来验证。

同时对四川榛子资源来说，尽管目前采集到了部分资源，然而部分资源数量不足，藏刺榛、披针叶榛目前尚未采集到资源，因此要对四川榛子资源进行较全面的评价与利用，也需要进一步的调查与研究。