RP-HPLC同时测定消风止痒颗粒中9种化学成分

王月清

（东南大学附属中大医院 江北院区药剂科，江苏 南京 210048）

消风止痒颗粒收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十五册》，具有消风清热，除湿止痒的作用。主治丘疹样荨麻疹及湿疹、皮肤瘙痒症[1]。该中成药由防风、荆芥、苍术、地黄、当归、木通、蝉蜕、亚麻子、地骨皮、石膏、甘草11味药材组成，目前，该质量标准仅对防风及木通两味药材进行薄层色谱鉴别及颗粒剂项下的常规检查，并无含量测定项控制，涉及药材有限，专属性差，不能全面评价消风止痒颗粒的质量。文献报道中对于消风止痒颗粒的定量都以1～2个成分为指标进行测定[2-3]。消风止痒颗粒中防风辛甘性温，散表寒，擅于祛一切之风，荆芥味辛性温，两者合为君药，疏风以止痒[4-5]；苍术辛苦而温，健脾燥湿，祛湿止痒，地黄、当归滋阴养血、活血，可增防风、荆芥驱风之力，合为臣药[6-8]；木通、蝉蜕、亚麻子、地骨皮、石膏俱为佐药，能清热利湿、透疹除痒[9-10]；甘草清热解毒，调和诸药为使药[11]。根据《中国药典》对于单味中药的质量标准，防风的指标成分为升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷，荆芥的指标成分为胡薄荷酮，当归的指标成分为阿魏酸，苍术的指标成分为苍术素，地黄的指标成分为梓醇与毛蕊花糖苷，甘草的指标成分为甘草苷与甘草酸铵，确定采用9种化学成分控制该中成药的质量。因此，本研究从多种有效成分同时监控的角度出发，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC），通过波长切换法，同时测定上述9种化学成分含量，为消风止痒颗粒质量标准的提升提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，包括 G1311A四元梯度泵，G1329A自动进样器，G1314B-DAD检测器，G1316A柱温箱，Agilent-Chemistation数据处理系统）；CPA225D电子天平（d=0.01 mg，德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

梓醇对照品（批号：110808-201711，含量：99.6 %），阿魏酸对照品（批号：110773-201915，含量：99.4 %），毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201914，含量：95.2 %），苍术素对照品（批号：111924-201806，含量：99.5 %），升麻素苷对照品（批号：111522-201913，含量：94.6 %），5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号：111523-201811，含量：97.4 %），胡薄荷酮对照品（批号：111706-201907，含量：99.4 %），甘草苷对照品（批号：111610-201908，含量：95.0 %），甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，含量：96.2 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。市售消风止痒颗粒8批，规格：8 g/袋，分别购自陕西华西制药股份有限责任公司（批号：20191121，20200407，20200529，20200618）及吉林紫鑫药业有限公司（批号：20191212，20200325，20200418，20200602）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵对照品各适量，分别置20 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，得含梓醇226.9 μg/ml、阿魏酸116.5 μg/ml、毛蕊花糖苷211.3 μg/ml、苍术素100.7 μg/ml、升麻素苷127.2 μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷124.8 μg/ml、胡薄荷酮200.5 μg/ml、甘草苷94.81 μg/ml和甘草酸铵102.9 μg/ml的混合对照品溶液，室温避光保存，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取消风止痒颗粒10袋，研匀，称取细粉约4.0 g，精密称定，置100 ml棕色量瓶中，加入85 %甲醇溶液约80 ml，20 ℃超声处理（450 W，40 kHz）45 min，取出，放冷至室温，用85 %甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按消风止痒颗粒的处方比例，分别制备缺防风、荆芥、苍术、当归、地黄、甘草的阴性样品，并按2.1.2项下方法分别制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件[12-14]

色谱柱：Waters XTERRA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-1.5 mmol/L KH2PO4溶液（稀磷酸调节pH值至3.5）（25:75）（B），梯度洗脱，程序见表1。流速：1.0 ml/min，柱温35 ℃。

表1 梯度洗脱程序

2.3 系统适用性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μl注入色谱仪，色谱记录时间：50 min，理论塔板数以梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵峰计均大于4800，各待测成分与前后峰分离度均大于1.5，各峰的对称因子均在0.93～1.14之间，色谱图见图1。

图1 系统适用性试验HPLC图谱

2.4 线性关系考察

分别精密吸取2.2.1项下混合对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，置于同一25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（x，μg/ml），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明：梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵在试验范围内呈良好的线性关系，见表2。

2.5 检测限和定量限

将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0 时的浓度为各成分的检测限（LOD），S/N约为10.0 时的浓度为各成分的定量限（LOQ）。结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.6 精密度试验

精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液10 μl，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别0.95 %，1.02 %，0.85 %，0.91 %，0.82 %，0.88 %，0.96 %，0.79 %，0.59 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一消风止痒颗粒供试品溶液（批号：20200529），分别于制备后0，3，6，9，15，20，24 h，按2.2项下色谱条件测定，记录峰面积。结果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵峰面积的RSD分别为1.23 %，1.06 %，0.97 %，1.09 %，0.89 %，0.78 %，0.92 %，0.57 %，0.81 %（n=7），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取同一批消风止痒颗粒（批号：20200529）6份，按2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定。结果梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵的平均质量浓度分别为0.4117，0.2433，0.4002，0.1588，0.2571，0.2539，0.3856，0.1007，0.1265 mg/g，RSD分别0.99 %，0.81 %，1.06 %，1.01 %，1.14 %，0.78 %，1.32 %，1.05 %，1.03 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.9 加样回收试验

取已知含量的消风止痒颗粒（批号：20200529）细粉6份，每份约2.0 g，精密称定，分别置于100 ml棕色量瓶中，精密加入梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵混合对照品溶液（浓度分别为0.2269，0.1165，0.2113，0.1007，0.1272，0.1248，0.1029，0.09481，0.1029 mg/ml）4.0 ml，按2.1.2项下供试品溶液方法制备，再按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图，计算平均加样回收率分别为99.74 %，99.21 %，99.54 %，99.03 %，99.91 %，98.99 %，100.04 %，98.79 %，99.09 %，RSD分别为0.55 %，0.92 %，0.69 %，0.81 %，1.13 %，0.72 %，1.14 %，0.59 %，0.68 %（n=6），表明该方法准确可靠，具体数据见表3。

表3（续）

2.10 耐用性试验

分别考察了3种不同品牌色谱柱（Waters XTERRA C18、Agilent Zorbax C18、Welch ultimate xb-C18，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）对消风止痒颗粒含量的影响。结果在不同色谱柱上测得梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵的含量RSD依次为1.07 %，1.13 %，1.09 %，1.22 %，0.98 %，1.16 %，1.38 %，1.46 %，1.25 %，RSD均小于2.0 %，表明此方法耐用性较好。

2.11 样品测定

取8批消风止痒颗粒样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定，外标法计算样品中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵的质量浓度，结果见表4。8批次消风止痒颗粒中梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵质量浓度分别为0.4101～0.4359 mg/g，0.2409～0.2448 mg/g，0.3989～0.5109 mg/g，0.1571～0.1599 mg/g，0.2557～0.2582 mg/g，0.2511～0.2551 mg/g，0.3842～0.3866 mg/g，0.1001～0.1018 mg/g，0.1251～0.1276 mg/g。结果表明消风止痒颗粒各批次之间9种成分的含量基本稳定。

表4 消风止痒颗粒中9种成分含量的结果（n=3）

3 讨论

本实验利用DAD在190～400 nm波段范围内扫描，得到苍术素、阿魏酸与毛蕊花糖苷最大吸收波长为330 nm；甘草苷与甘草酸铵最大吸收波长为237 nm；升麻素苷与 5-O-甲基维斯阿米醇苷最大吸收波长为254 nm，胡薄荷酮最大吸收波长为252 nm。254 nm虽不是胡薄荷酮的最大吸收波长，但在此波长下，胡薄荷酮、升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷峰形比较理想，杂质峰干扰较小，能达到方法学考察要求，因此选择在254 nm下测定胡薄荷酮、升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷3个组分，故研究采用分段变换波长检测法对9种成分进行测定。

研究中考察对比了不同流动相系统（甲醇-水溶液、甲醇-磷酸溶液、甲醇-磷酸二氢钾溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氢钾溶液、乙腈-磷酸二氢钠溶液）、柱温（30、35、40 ℃）对分离效果的影响，最终确定了2.2项下色谱条件。

本研究共测定两个厂家8个批次的消风止痒颗粒，均检测出梓醇、阿魏酸、毛蕊花糖苷、苍术素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、甘草苷和甘草酸铵9个成分，结果表明同一厂家生产的不同批次产品中9种成分的含量差异不大，不同厂家产品中梓醇和毛蕊花糖苷含量有一定差异，这可能与不同厂家地黄的药材品种和质量有关。

本研究首次建立HPLC同时测定消风止痒颗粒中9种成分的方法，操作简便、结果准确，可作为消风止痒颗粒多指标定量测定方法。