乳腺癌手术切除患者放疗前后PBMC中BIRC5、RunX2 mRNA变化及与预后的关系

冯瑞刚 张帆 王鹏 王毅 李凯敏

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，居癌症发生率和死亡率首位［1］。目前，乳腺癌改良根治术在我国仍乳腺癌主要手术方式，术后放疗可降低局部复发率，提高总生存率［2］。而研究放疗疗效及预后的预测因子，对乳腺癌个体化治疗开展具有重要临床意义。细胞凋亡抑制因子5（Baculoviral IAP repeatcontaining 5，BIRC5）被认为是迄今发现最强凋亡抑制因子［3］。越来越多研究证实，BIRC5 在多种肿瘤组织中高表达，且与肿瘤转移、复发、预后密切相关［4-5］。核心结合因子（Core binding factor-α，RunX2）是参与骨髓间质干细胞成骨分化和骨发育的重要转录因子，与多种肿瘤生物行为有关［6］。乳腺是RunX2 表达量最高的组织之一，研究报道，乳腺癌组织中RunX2 表达上调，且与临床预后相关［7］。基于此，本研究尝试分析乳腺癌手术切除患者放疗前后外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中BIRC5、RunX2mRNA 变化及与预后的关系。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河北省保定市第二中心医院普外科2017年3月至2018年3月84 例乳腺癌患者作为观察组，另选择同期健康体检者42 例作为对照组。纳入标准：观察组均经组织病理［8］，术前未行放疗和化疗；术前检查未见远处转移；研究对象均知情同意。排除标准：合并其他部位肿瘤；严重感染及免疫系统、血液系统疾病；肝、肾等器官严重病变；妊娠或哺乳期患者。观察组年龄平均（55.26±7.65）岁，体质量指数（BMI）平均（22.53±1.85）kg/m2，临床分期：Ⅱ期33例，Ⅲ期51 例，分化程度：中高分化46 例，低分化、未分化38 例；对照组年龄平均（56.41±8.26）岁，BMI 平均（22.71±2.04）kg/m2。两组年龄、BMI 均衡可比（P＞0.05），本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

观察组均于乳腺癌改良根治术后进行放疗，方法：于胸壁和锁骨上区分别采用6 MV、9 MV 电子线照射，经16 次照射后，于胸壁处加以0.5 组织等效膜，2 Gy/次，5 次/周，总量直至50 Gy。以21 d为1 个疗程，共放疗2 个疗程。观察组于放疗前、放疗2 个疗程后取肝素抗凝血5 mL，对照组直接采集肝素抗凝血5 mL，淋巴细胞分离液分离PMBC，使用Trizol 试剂提取细胞内总RNA，以RNA为模板行逆转录，然后进行荧光定量PCR 扩增，采用2-ΔΔct法计算BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计数资料以n（%）描述，计量资料以（）描述，两组间比较用t检验，多组间用F检验；影响因素采用Logistic 回归分析；采用Pearson 分析相关性；Kaplan-Meier 生存曲线分析生存率，采用Log-Rank 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组病理图

女，57 岁，经组织病理检查证实为乳腺癌，临床分期为Ⅲ期，组织病病理表现见图1。

图1 组织病理学特征（HE，×200）Figure 1 Histopathological characteristics（HE，×200）

2.2 观察组放疗前后与对照组PBMC 中BIRC5、RunX2 相对表达量比较

观察组放疗前、后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组放疗后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量低于放疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 观察组放疗前后与对照组PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of the relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in the PBMC of the observation group before and after radiotherapy and the control group（±s）

表1 观察组放疗前后与对照组PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of the relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in the PBMC of the observation group before and after radiotherapy and the control group（±s）

注：与观察组放疗前比较，aP＜0.05；与观察组放疗后比较，bP＜0.05。

组别观察组对照组F 值P 值放疗前放疗后n 84 84 42 BIRC5 mRNA 4.06±0.67b 2.13±0.49a 1.70±0.22ab 388.019＜0.001 RunX2 mRNA 0.84±0.10b 0.63±0.07a 0.40±0.03ab 456.954＜0.001

2.3 放疗前后PBMC中BIRC5、RunX2表达量相关性

放疗前、放疗后PBMC 中BIRC5、RunX2表达量均呈正相关（r=0.647、0.558，P＜0.05）。

2.4 放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 表达量与临床病理特征的关系

放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量与年龄、原发肿瘤直径无明显相关性（P＞0.05）；放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量与临床分期、分化程度、淋巴结转移显著相关（P＜0.05）。见表2、3。

表2 不同临床病理特征患者放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in PBMC of patients with different clinicopathological characteristics before and after radiotherapy（±s）

表2 不同临床病理特征患者放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of the relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in PBMC of patients with different clinicopathological characteristics before and after radiotherapy（±s）

临床病理特征年龄＜60 岁≥60 岁t 值P 值原发肿瘤直径＜5 cm≥5 cm t 值P 值临床分期Ⅱ期Ⅲ期t 值P 值分化程度中高分化低分化、未分化t 值P 值淋巴结转移无有t 值P 值n 35 49 24 60 33 51 46 38 26 58 BIRC5 mRNA放疗前4.10±0.73 4.03±0.68 0.451 0.653 4.04±0.69 4.07±0.65 0.188 0.852 3.52±0.40 4.41±0.82 5.796＜0.001 3.63±0.44 4.58±0.73 7.360＜0.001 3.65±0.39 4.24±0.57 4.791＜0.001放疗后2.11±0.39 2.14±0.36 0.364 0.717 2.10±0.28 2.14±0.35 0.499 0.619 1.66±0.28 2.43±0.62 6.696＜0.001 1.74±0.35 2.60±0.60 8.186＜0.001 1.80±0.22 2.28±0.43 5.373＜0.001 RunX2 mRNA放疗前0.82±0.09 0.85±0.11 1.327 0.188 0.83±0.08 0.84±0.10 0.437 0.664 0.78±0.08 0.88±0.10 4.828＜0.001 0.77±0.06 0.92±0.09 9.119＜0.001 0.80±0.05 0.86±0.06 4.449＜0.001放疗后0.61±0.07 0.63±0.09 1.072 0.287 0.61±0.09 0.64±0.12 1.105 0.272 0.56±0.07 0.68±0.09 6.489＜0.001 0.52±0.05 0.76±0.06 20.001＜0.001 0.57±0.04 0.66±0.07 6.111＜0.001

2.5 3年生存率

随访3年，失访3 例，81 例乳腺癌患者3年生存率为79.01%（64/81）。

表3 放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量与临床病理特征的关系Table 3 The relationship between the relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in PBMC before and after radiotherapy and clinicopathological characteristics

2.6 放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量患者3年生存率

不同生存分析根据观察组所有患者放疗前、放疗后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 相对表达量平均值为界，分为低表达与高表达。KM 曲线分析，放疗前、放疗后PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA高表达患者3年生存率低于低表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 放疗前后PBMC 中BIRC5、RunX2 mRNA 相对表达量患者3年生存率Figure 2 3-year survival rate of patients with relative expression of BIRC5 and RunX2 mRNA in PBMC before and after radiotherapy

3 讨论

如何早期预测疗效及预后，进行个体化治疗是目前临床进行肿瘤治疗的热点。乳腺癌术后放疗的地位在不断提高，而对于放疗疗效及预后的监测，形态影像学无法进行早期预测评估。因此，探索可预测、监测及评估乳腺癌术后放疗疗效及预后的生物学指标具有重要临床价值。

RunX2 属runt 域基因家族，是特异性成骨分化转录因子，参与骨髓间质干细胞成骨分化，已被证明与成骨、骨肉瘤发生发展密切相关，通过溶骨、肿瘤血管新生等途径促进癌细胞转移［9］。乳腺是RunX2 表达量最高的组织之一，近年研究显示，RunX2 在乳腺癌发生、发展中也发挥重要作用［10］。曾勇等［11］通过免疫组化检测乳腺癌和癌旁组织中RunX2 表达情况，发现，乳腺癌组织中RunX2 高度表达率62.50%明显高于癌旁组织25.00%。雌激素受体（ER）是乳腺细胞生长、分化的重要调节因子，其表达量是乳腺癌疗效和预后判断的重要指标。胡滨等［12］研究发现，乳腺癌组织RunX 表达与ER 表达相关，进一步显示了RunX2 对乳腺癌发生发展的重要作用。BIRC5 是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中结构最简单、抗凋亡作用最强的蛋白分子。BIRC5基因仅含一个杆状病毒IAP 重复序列，其生物学功能复杂，如促进细胞转化、抑制细胞凋亡、参与细胞有丝分裂、诱导耐药性产生等。BIRC5 抑制细胞凋亡的机制可能为，①直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和Caspase-7 活性，阻断细胞凋亡过程；②与周期蛋白激酶CDK4、CDK2 相互作用，使凋亡信号转导通路被阻断［13］。同时，BIRC5 通过细胞周期依赖性表达，可抑制G2/M 期细胞凋亡［14］。研究证实，肝癌、前列腺癌、乳腺等组织中BIRC5 表达上调，且与临床分期、转移、复发、病理分级及多药耐药呈明显相关［15-16］。Ghaffari 等［17］研究显示，乳腺癌患者BIRC5基因拷贝数显著增加，可能参与肿瘤发生。张建武等［18］通过分析癌症基因组图谱数据库发现，多种乳腺癌存在BIRC5基因高表达，且BIRC5基因表达与患者预后密切相关，BIRC5 敲低后，乳腺癌细胞生长受抑。本研究数据提示提示BIRC5、RunX2 异常表达可能与乳腺癌发生发展密切相关。进一步分析表明BIRC5、RunX2 可作为乳腺癌诊治及预后评价的分子标记物，在乳腺癌患者采用针对BIRC5、RunX2 靶点的干预可能是治疗乳腺癌的策略之一。

本研究初次分析PBMC 中BIRC5、RunX2 在乳腺癌放疗期间的动态变化发现BIRC5、RunX2与乳腺癌患者预后密切相关，有望成为临床上预测乳腺癌预后的有效生物标志物。另外，放疗前、放疗后PBMC 中BIRC5、RunX2 表达量均呈正相关，推测乳腺癌患者BIRC5、RunX2 表达可能存在反馈调节关系，共同影响临床病理特征及预后，但具体通路有待进一步论证。本研究局限性在于作为单中心、小样本分析，可能造成数据偏移，需进一步采取多中心、大规模探究，以获取更可靠的数据支持。

综上可知，乳腺癌改良根治术后放疗患者放疗后外周 血PBMC 中BIRC5、RunX2mRNA 表 达降低，与患者预后密切相关，可作为乳腺癌放疗后预后重要指标，对乳腺癌个体化治疗开展具有重要临床意义。