晚期糖基化终末产物的检测方法

焦淑玲，权科佳，何孝文，毋卓，曾宝平，南禧辰，杨阳

（西安医学院 药学院 药物研究所，陕西西安710021）

晚期糖基化终末产物（ Advanced Glycation Endproducts，AGEs）是由大分子物质（如氨基酸、蛋白质和核酸）的末端氨基与还原糖（如葡萄糖、戊糖和木糖）的羰基在非酶促条件下发生亲和加成反应，生成可逆的席夫碱，席夫碱发生Amadori 重排生成稳定的醛胺类物质，醛胺类物质经过一系列的脱氢、氧化和重排反应生成羰基化合物，高活性的羰基化合物与蛋白质的自由基、巯基等功能基反应使之变性，最后生成稳定的AGEs[1]。按照来源分类，AGEs 分为内源性AGEs 和外源性AGEs。内源性AGEs 主要由体内大分子物质经美拉德反应而来，外源性AGEs 主要来源于含高脂肪、高蛋白质的经高热、油炸的食品[2]。按照是否自带发色基团分类，AGEs 分为非荧光AGEs和荧光AGEs，非荧光AGEs 有羧甲基赖氨酸（CML）、羧乙基赖氨酸（CEL）、吡咯素（Pyr），荧光AGEs 有戊糖苷和甲基乙二醛赖氨酸二聚体（MOLD）[3]，其结构式如图1 所示。糖尿病及其并发症的引发，炎症的产生、病变过程和人体骨质量、骨质交联变化等均与AGEs 的体内累积有关[4-6]，食品和生物样品中AGEs的检测对于糖尿病及其并发症、炎症的预诊和骨折风险的评估等具有指导意义。现常用酶联免疫吸附法（ELISA 法）、光谱法、色谱连用等方法检测AGEs。

图1 常见AGEs 结构式

1 ELISA 法

朴奎英等[7]对特应性皮炎（AD）患者和健康者的血样和角质细胞进行了AGEs、可溶性AGEs 受体（sRAGE）和内源性分泌RAGE（esRAGE）的检测，利用ELISA 试剂盒对血液和角细胞中的蛋白质表达水平进行定量检测，用ELISA 抗体检测CML 表位，通过比较样品光密度（O.D）和标准曲线来确定每个靶蛋白的浓度。结果显示，AD 患者角质细胞中AGEs水平要高于健康者，同一患者病变部位与非病变部位平均AGEs 水平无明显差异，角质细胞中AGEs 水平与AD 患者病情严重程度呈正相关；AD 患者与健康者血清中AGEs 的含量几乎无差异，但AD 患者血清中sRAGE 水平明显高于健康受试者。蒋明昌[6]利用ELISA 法测定血清戊苷和CML 与体重指数（BMI）的关系，得出人体BMI 越大，血清戊苷和CML 的含量越低。彭伟等人[8]利用ELISA 法对乳腺癌患者进行血清中AGEs 水平的测定，发现乳腺癌患者组AGEs水平明显高于乳腺良性疾病组和健康受试组，进一步分析乳腺癌患者治疗前血清，发现AGEs 水平与患者区域淋巴结转移状况及临床分期密切相关。两次分析表明AGEs 与乳腺癌的侵袭和扩散有关。有研究显示，糖尿病与乳腺癌的病程有关，且AGEs 高表达于糖尿病患者和乳腺癌患者体内，因此检测人血清中AGEs 水平对于治疗乳腺癌或糖尿病合并的乳腺癌具有重要意义。

2 光谱法

2.1 傅立叶变换红外（FTIR）成像法

Schmidt 等人[9]利用傅立叶变换红外成像检测不同年龄段人体骨胶原蛋白中非酶交联（AGEs）形成过程的光谱变化。非酶交联相关的胶原质量的二维（2D）空间分布可通过酰胺Ⅰ峰内1 678/1 692 cm-1子带的面积比测量，此比值称为非酶交联比（NE-xLR）。结果显示：随着组织年龄的增加或骨病态情况下，骨区域（即间质骨）中非酶交联的积聚增强。

2.2 荧光光谱法

朱健铭等人[10]将AGEs 标准溶液配制成7 种不同的浓度，通过荧光分光光度计对其含量进行检测，并绘制荧光峰值强度与浓度的标准曲线，发现以370 nm 为激发波长，在470 nm 发射波长处可观察到明显的荧光峰值，相关系数R2=0.997，表明荧光光谱法对离体的AGEs 进行检测具有可行性。Steenbeke等人[11]以360 nm 作为激发波长，在400～620 nm 发射波长范围内对慢性肾病患者和健康受试者尿中AGEs 的含量进行检测，发现慢性肾病患者尿中的AGEs 含量明显高于健康受试者。杨成会等人[12]对荧光检测皮肤AGEs 的方法在糖尿病及其并发症发生风险评估中的应用进行了综述，表明荧光光谱法检测皮肤AGEs 对糖尿病及其并发症发生风险的预测有一定的临床意义。

3 色谱联用技术

3.1 气相色谱串联质谱法（GC-MS）

CML 为非荧光AGEs，且难挥发，使用GC-MS 前需对其进行柱前衍生，Wang 等人[13]用甲醇和三氟乙酸对大菱鲆肌肉中的CML 进行羧基酯化和氨基酰化，用GC-MS 对其进行检测，发现CML 三氟乙酰甲酯化衍生物峰面积与浓度在1～200 μg/L 范围内呈良好线性关系，检出限为1 mg/kg，定量限为5 mg/kg，且GC-MS 法对于大菱鲆肌肉中CML 的检测具有较高灵敏度。

3.2 高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）

Chen 等人[14]以邻苯二甲醛为衍生化试剂在硼酸钠缓冲溶液（pH=9.7）中对CML 进行衍生，用反相凝胶ODS 柱对CML 进行分离，设置340 nm 为激发波长，455 nm 为发射波长，使用FLD 检测熟肉中CML 的含量，发现在较高的温度下经蒸煮、烤制或油炸的肉类产品可产生大量CML，本方法的定量限为5.0 ng/mL，检出限为1.5 ng/mL。Nakano 等人[15]对测试样品加热，使用HPLC-FLD 对加热样品中戊糖素苷进行测定，发现加热的样品与未加热的样品相比，戊糖素苷的含量增加了1.1～4.2 倍。

3.3 高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UVD）

Pyr 具有强的紫外吸收特性，刘慧琳等人[16]采用固相萃取-HPLC-UVD 对食品中Pyr 含量进行检测，发现Pyr 在5×10-7～2×10-3mol/L 浓度范围内呈现良好的线性关系，检测限为5×10-7mol/L。周凯文等人[17]首次将超声提取法用于Pyr 提取，采取HPLC-UVD 对食品中Pyr 的含量进行检测分析，发现酱油和咖啡中Pyr 的含量最高，分别为18.42 μg/mL、11.27 μg/L。

3.4 高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）

Hull 等[18]人测定食品中CML 时，为增加CML在C18 柱上的保留时间，在洗脱液中加入了离子对试剂，但离子对试剂会降低色谱柱的寿命、污染质谱的离子源。为减小离子对试剂对实验结果的影响，孙晓华等人[19]换用亲水作用色谱柱（HILIC）对食品CML 进行分离，通过HPLC-MS 检测15 种来源不同的油条中CML 的含量，其含量范围为（5.3±0.5）～（15.4±0.3）mg/kg，回收率范围为89.5%～99.1%，相对标准偏差范围为2.1%～2.6%，仪器的检出限为1 ng/mL，定量限为3 ng/mL。朱玉洁等人[20]使用固相萃取-UPLC-MS/MS 法对煎炸食物中CML 和CEL的含量进行测定，分析显示CML 和CEL 在0.01～1.00 μg/mL 浓度范围内线性良好，相关系数R2为0.999 4～0.999 5，检出限均为15.0 μg/kg，定量限均为45.0 μg/kg。Courten 等人[21]用UPLC-MS 检测尿、血浆和膳食中AGEs 含量，分析食用含有AGEs 的食物对胰岛素敏感性的影响，发现食用含有AGEs 含量低的食物可以降低尿中AGEs 的浓度，同时可以改善胰岛素的敏感性。

对AGEs 的定性分析，HPLC-MS 应用也较广泛。Nomi 等人[22]利用HPLC-MS 对啤酒中AGEs 进行分析，首次证明了啤酒中存在CML、CEL。Zhang 等人[23]利用HPLC-MS 对生杏仁和熟杏仁中AGEs 进行分析测定，发现生杏仁与熟杏仁中均含有CML 和CEL，且首次在烤杏仁中发现了嘧啶。

细胞膜固相色谱是以生物大分子作为固定相，化学成分作为流动相的一项新兴色谱技术，主要研究生物大分子与化学成分之间的关系。朱毛毛等人[24]采用细胞膜固相色谱技术对奶粉中存在的特异性AGEs进行筛选，HPLC-MS/MS 对其进行分析，发现牛奶中主要含有CML、CEL、Pyr 三种AGE。CML、CEL检出限为1 ng/mL，定量限为5 ng/mL；Pyr 检出限为3 ng/mL，定量限为7 ng/mL。

4 糖基化终产物检测仪（AGE-reader）

AGE-reader 主要由紫外线灯管、光纤、光谱仪组成。紫外线灯管发出一定范围的激发光，使皮肤中荧光AGEs 产生荧光，通过光纤接受，将观察到的自体荧光性表达为AFR（可以与荧光反应的AGEs 的含量）。Hagen 等人[25]利用AGE-Reader 来检测人前臂掌侧内的AGEs，通过皮肤自发荧光强度（SAF）来反映AGEs 在皮肤中的浓度与情感障碍之间的关系，其中SAF 指皮肤AGEs 含量的高低，研究发现SAF 与情感障碍中抑郁症的发病率略有关联，与其他情感障碍的持续或复发无显著关联。

5 AGEs 荧光检测仪（DM Scan）

DM Scan 的基本原理是采用安全光源激发人体皮肤的荧光性AGEs，根据获得的光学信号来反应AGEs 的积聚量。刘林等人[26]以370 nm 单色光作为激发波长，用DM Scan 检测社区自然人群皮肤中AGEs 的SAF，以此探讨社区自然人群皮肤中AGEs的SAF 与动脉粥样硬化斑块的关系，用统计学方法比较和计算有颈动脉粥样硬化和无颈动脉粥样硬化受试者的SAF 值，计算得P＜0.001，表明差异有统计学意义。此实验证明在吸烟人群中，SAF 高值组患颈动脉粥样硬化斑块的风险是SAF 低值组的1.903倍，P=0.001，表明SAF 与颈动脉粥样硬化独立相关。

6 荧光传感检测法

Liu 等人[27]利用荧光传感检测法检测婴幼儿配方奶粉、面包以及巴氏消毒牛奶中的CML。其原理是以半导体纳米材料-量子点为荧光核心，3-氨丙基-3-乙氧硅烷为功能单体，四乙氧基硅烷为交联剂，建立CML 分子印迹聚合物，进而检测食品中CML 含量[4]。发现在5～400 ng/mL 浓度范围内，被检测物质的相对荧光强度随着CML浓度的升高而下降，此法检测限为2.6 ng/mL。

7 结语

AGEs 在体内的堆积不仅会提高骨折风险、增强乳腺癌的侵袭和转移能力还会引发糖尿病及其并发症。对血清、皮肤等生物样本中AGEs 的检测可监测糖尿病及其并发症的发展状况，监测血清中AGEs 水平对于建立乳腺癌及糖尿病合并乳腺癌的诊断、治疗方法具有深远意义，对食品中外源性AGEs 的检测可以为糖尿病、乳腺癌、抑郁症患者提供饮食指导。

目前用于AGEs 检测的方法虽多，但具有一定的局限性。ELISA 法利用待测抗原和固有抗原竞争结合来测定待测样品中的AGEs，此方法虽灵敏性高、特异性高、操作简便，但AGEs 作为抗原时在体内可以与自身抗体反应生成抗原抗体复合物影响检测结果。傅立叶红外光谱法操作简单易行，荧光光谱法具有较好的准确性、稳定性和较强抗干扰能力，可实现对AGEs 的快速定量检测。AGEs Reader、荧光传感器等新技术检测限低，灵敏度高，样品耗费少，但也只适用于荧光性AGEs。色谱联用技术虽具有高效性、灵敏度高、分辨率高等特点，但大部分AGEs 都为非荧光AGEs，而采用色谱联用技术均需柱前衍生，操作复杂耗费高，因此难在临床中普及。目前为止尚未发现可以同时检测荧光性和非荧光性AGEs 的检测方法，标准化的AGEs 检测方法也尚未建立。