VHP 灭菌技术在无菌检查试验中的应用

冯婷，钟勇，杨瑞，杨立，陶昆蓉，刘竞鸥，户美玲，严东珍

（成都生物制品研究所有限责任公司，四川成都 610023）

过氧化氢（hydrogen peroxide）是一种无机化合物，化学式H2O2。过氧化氢液体可与水任意比例混溶，是一种强氧化剂，水溶液俗称双氧水，为无色透明液体，在一般情况下会缓慢分解成水和氧气[1]。VHP 生物灭菌技术于20 世纪末前后提出，是一种在常温状态下将液态过氧化氢转换成气态过氧化氢进行灭菌消毒的技术。有实验证明，与杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌孢子相比，汽化过氧化氢灭菌更容易杀灭枯草芽孢杆菌亚种孢子[1]。该技术目前已被应用于无菌隔离器、厂房灭菌等领域。空间灭菌的原理和特点为：过氧化氢液体在高温下瞬间快速蒸发为蒸汽，这些过氧化氢蒸汽被气流送入灭菌环境，生成游离的氢氧基，通过进攻细胞成分，如脂类、蛋白质和DNA，从而破坏微生物组织，更具高效、快速、无毒、无残留的优越性[2]。鉴于上述特点，将VHP 灭菌技术用于疫苗无菌检查样品、器皿的外表面灭菌中，可以提高试验的准确性。

1 材料与方法

1.1 VHP 简介

VHP 传递窗主要由传递窗箱体、新风系统、排风系统、循环系统、过氧化氢灭菌系统电气控制系统组成。双扉门结构从低洁净等级区域（D 级）向高洁净等级区域（B 级）传递物品时，设备启动VHP 灭菌程序，实现VHP 灭菌的功能，完成窗体内灭菌及传递；从高洁净等级区域（B 级）向低洁净等级区域（D 级）传递物品时，该传递窗可实现普通传递窗的功能。检验区D 级和B 级外部区域设有操作界面，配有转移车和货架，内部有垂直层流装置，上部有出风口，下部有测回风，送、排风的高效过滤效率≥99.995%（＞0.3 μm）。传递窗门与箱体间采用充气密封方式密封，应确保在灭菌时房间的过氧化氢浓度低于1 mg/L 的安全限定值，门采用不锈钢边框加钢化玻璃视窗结构，便于灭菌过程中对传递窗内部进行观察[3]。

1.2 主要材料

1.2.1 样品

乙型脑炎减毒活疫苗及无菌检查相关用具。

1.2.2 试剂与器具

硫乙醇酸盐流体培养基（FT）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂（TSA）均在培养基室制备，灭菌及适用性检查均符合2020 版《中国药典》的要求；培养皿（直径90 mm）、血浆瓶、TSA（L-80）接触碟（直径55 mm）。

1.2.3 菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]，来源于中国医学细菌保藏管理中心。

1.2.3 设备

BHC-1000DA2 型生物安全柜，浙江泰林；HTY-601 型电脑集菌仪，浙江泰林；CN330 型集菌培养器浙江泰林 ；孵室，20 ～25 ℃、30 ～35 ℃，成建。

1.3 研究方法

1.3.1 准备（参数设定和最大装量设置）

将VHP 传递窗参数设为固定参数：湿度40%RH，调节阶段调节流量3.0 g/min，时间30 min；灭菌阶段灭菌流量2.5 g/min，灭菌时间40 min；通风时间90 min

最大装载设置如图1所示。第一层：集菌杯50套、供试品400支（西林瓶）；第二层：工具箱4箱；第三层：供试品45 瓶（250 mL 血浆瓶）、蛋白胨溶液30 瓶（250 mL 血浆瓶）；第四层：消毒液桶2 个、培养基140 瓶（250 mL 血浆瓶）、培养基中试管500 支（置于试管架上）。

图1 最大装载示意图

1.3.2 密闭性测试

进入测试界面，开启压力测试，舱体自动充气使压力上升至100 Pa 以上，稳定120 s 后自动测试128 s，小时泄露率Q/V≤0.5%[小时泄露率=60×（起始绝对压力-结束时的绝对压力）/（起始绝对压力×压力下降时间均值]，系统自动判定结果。

1.3.3 过氧化氢气体分布测试

每层货架分布6 张过氧化氢指示剂（分别摆在4 个角和中间左右位置），在过氧化氢灭菌过程中观察每张过氧化氢指示剂的变色情况。

1.3.4 BI 挑战性实验

将芽孢含量大于106的灭菌生物指示剂每层货架分布6 张（分别摆在4 个角和中间左右位置），经VHP 灭菌后再进行培养，观察结果。

1.3.5 培养基灵敏度试验

1.3.5.1 菌悬液制备

取金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌菌种接种至胰酪大豆胨琼脂斜面上，30 ～35 ℃下培养18 ～24 h；取白色念珠球菌菌种接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20 ～25 ℃下培养24 ～48 h；取生孢梭菌菌种接种至硫乙醇酸盐流体培养基上，30 ～35 ℃下培养18 ～24 h；取上述培养物，采用10 倍稀释法，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL 含菌落数不大于100 CFU 的菌悬液。取黑曲霉菌种接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20 ～25 ℃培养7 d，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL 含菌落数不大于100 CFU 的孢子菌悬液。

1.3.5.2 菌落计数

将灭菌后的胰酪大豆胨肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基和100 CFU 阳性对照菌密闭好，再进行阳性实验，观察结果。

2 结果与分析

2.1 密闭性测试

小时泄露率Q/V≤0.5%，系统自动判定舱体密封性测试合格。

2.2 过氧化氢分布测试

开启灭菌程序后，全程观察，每隔2 min 记录一次过氧化氢浓度读数及相对湿度读数。运行全部结束后开门观察：过氧化氢化学指示剂肉眼可见均由绿色变为了黄色，过氧化氢气体状态分布合格。

表1 过氧化氢分布测试结果

2.3 BI 挑战性实验

灭菌后取出生物指示剂送至37 ℃培养，第一次培养24 h 后观察，培养液颜色均保持不变，再经24 h培养后进行第二次观察，培养液颜色仍保持不变（阳性对照的生物指示剂颜色培养后颜色由绿色变为黄色），BI 挑战性实验合格。

2.4 灵敏度实验

将灭菌后的胰酪大豆胨肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基在生物安全柜中灌入集菌杯，密封且熏蒸后的100 CFU 阳性对照菌（金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌）一起转至阳性区，然后硫乙醇酸盐流体培养基接种阳性对照菌（生孢梭菌、铜绿假单胞菌）胰酪大豆胨肉汤培养基接种阳性对照菌（白色念珠菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌），沙氏葡萄糖琼脂培养基接种阳性对照菌（黑曲霉）作为阳性参照。接种之前将阳性菌在无菌隔离器内暴露5 min 后进行接种，接种完成后将接有菌种的培养基放置在无菌隔离器中，待性能验证完成后将其取出，硫乙醇酸盐流体培养基放置20 ～25 ℃孵室和30 ～35 ℃孵室各一份培养3 d；胰酪大豆胨肉汤培养基放置20 ～25 ℃孵室培养5 d。如表3 所示，培养后的阳性菌均生长良好（阴性对照未长菌），VHP 灭菌后培养基灵敏度试验合格。

表2 BI 挑战性实验测试结果

表3 灵敏度实验结果

3 结论

VHP 空间灭菌技术符合GMP 要求，达到送检样品和器具外表面消毒的目的，同时避免了人工外表面消毒带来清洁效果不统一、不彻底等问题。由于其具有高效、无毒无残留、灭菌效果标准统一、效果可验证等优越性，因此能够为生产检定带来技术保证，并提高质量检定的可靠性。