脑卒中患者MTHFR基因多态性与H型高血压的相关性

张蕾，冯晓俊，秦立婷，陈昭琳，唐丽琴，沈爱宗

中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药剂科，安徽省心血管病研究所，合肥 230001

《中国脑卒中防治报告2018》指出脑卒中是我国成年人致死、致残的首位原因，其发病率及患病率整体呈上升趋势。研究表明高同型半胱氨酸血症增加脑卒中发病风险，高血压是脑卒中的重要危险因素，且两者在脑卒中发病中有协同作用[1]。针对我国高血压患者中约有3/4患有高同型半胱氨酸血症的现象，有学者提出将伴有高同型半胱氨酸血症的原发性高血压称为H型高血压的概念[2]。因此对于伴高同型半胱氨酸(Hcy)的高血压患者，需同时考虑血压和血清Hcy水平。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢途径中的一个关键酶，维持体内正常的Hcy水平。本研究通过采用PCR-芯片法对高血压患者的MTHFR C677T突变位点进行检测及酶循环法测定血清Hcy水平，分析MTHFR基因多态性与H型高血压及血清Hcy水平升高的相关性，为临床诊疗提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月至2018年12月于中国科学技术大学附属第一医院神经内科住院且数据资料较完整确诊为脑卒中患者中的高血压病患为研究对象。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：所有患者均符合《中国高血压防治指南(2018年修订版)》制定的高血压诊断标准[3]；高同型半胱氨酸血症诊断标准：血浆Hcy≥15 μmol/L。排除标准：所有入组患者均排除继发性高血压；近期服用叶酸、维生素B12、维生素B6等影响血清Hcy水平药物的患者；严重肝、肾、心功能不全者；合并恶性肿瘤者、自身免疫性疾病、血液系统疾病、内分泌疾病、精神疾病患者及妊娠或哺乳期妇女等人群；基本资料不全者。

1.3 仪器与试剂 主要仪器：SW-CJ-2D超净工作台(苏州净化)；HFsafe-1200TE生物安全柜(上海力康)；NES-32核酸提取仪(杭州艾康)；HC-2518高速离心机(安徽中科中佳)；V2S025旋涡混合器(德国IKA)；m-microcentrifuge微量台式离心机(美国Andybio)；CHB-T2金属浴(杭州博日)；ScanDrop2超微量核酸蛋白测定仪(德国耶拿)；定性PCR仪(美国ABI2720)；BR-526-24全自动杂交仪(上海百傲)；BE-3.0生物芯片识读仪(上海百傲)；单道可调移液器(芬兰百得)。主要试剂：全血基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)；MTHFR(C677T)基因检测试剂盒(PCR-芯片杂交法)；无水乙醇(化学纯)；异丙醇(分析纯)。

1.4 方法

1.4.1 一般资料的采集 通过检索医院病历系统，详细记录患者的性别、年龄、身高、体质量、血压、吸烟史、饮酒史等基本资料；高血压、糖尿病、高脂血症、脑梗死等既往病史；家族遗传史及用药史。患者的血Hcy、叶酸(FA)、维生素B12(Vit B12)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、糖化血红蛋白(HbA1c)等指标。

1.4.2 MTHFR基因多态性检测

1.4.2.1 血样采集 静脉取血1 mL，加至EDTA抗凝管中。

1.4.2.2 样本DNA提取 按照杭州艾康公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)说明书要求的流程操作，在96孔板的第1列及第7列中加入200 μL的待测样本、400 μL的异丙醇和20 μL蛋白酶K。按照核酸提取仪操作规程设置程序进行样本DNA自动提取。提取的DNA浓度采用ScanDrop2超微量核酸蛋白测定仪按照操作指南进行检测，浓度应在10～60 ng/μL之间，A260/A280比值在1.5～2.0之间。

1.4.2.3 PCR扩增 将分装好的扩增液，室温解冻，低速离心，加入反应液A 1 μL和DNA模板2 μL至液面下，瞬时离心混匀。运行扩增程序：50 ℃，5 min；94 ℃，5 min预变性；35个循环(94 ℃，25 s变性；56 ℃，25 s退火，72 ℃，25 s延伸)，72 ℃，5 min延伸。取出PCR扩增产物，2～8 ℃保存。

1.4.2.4 芯片杂交显色 按照百傲免疫显色试剂说明书，吸取MTHFR反应体系的扩增产物20 μL加入180 μL杂交缓冲液，制成杂交反应液。在已预装洗液和预杂交液的8联管，依次加入杂交反应液、抗体及显色液。在百傲全自动杂交仪上按照说明设置杂交程序，放入8联管，运行程序。反应结束后，取出芯片。将芯片放入生物芯片识读仪中，用百傲基因芯片图片分析软件(Baio Array Doctor)V3.0进行图像扫描判断样本的MTHFR基因型。

2 结果

2.1 MTHFR C677T等位基因及基因型分布频率 对122例患者进行MTHFR基因型检测，结果输出MTHFR三种基因型：677CC，677CT和677TT(见图1)。将患者分为野生纯合组(CC)32例，占比26.23%；杂合突变组(CT)53例，占比43.44%，纯合突变组(TT)37例，占比30.33%；在研究人群中，男性患者基因型分布频率为21.98% CC(20例)、43.96% CT(40例)、34.07% TT(31例)，等位基因频率为43.96% C、56.04% T；女性患者CC、CT、TT基因型频率为38.71% CC(12例)、41.94% CT(13例)、19.35% TT(6例)，等位基因频率为59.68% C、40.32% T。MTHFR C677T多态性的基因型频率分布在男性和女性患者相似，差异无统计学意义(P>0.05)，但在男性、女性患者的分布差异有统计学意义,男性患者等位基因T频率高于女性(P<0.05)。见表1。

图1 MTHFR C677T基因型及芯片图谱:A为CC型；B为CT型；C为TT型

表1 MTHFR C677T等位基因及基因型分布频率[例(%)]

2.2 临床基线资料 填写入选患者CRF表，进行统计分析。其中男性91例，女性31例，患者年龄38～75岁，年龄(58.0±8.7)岁。3种基因型患者年龄、性别、体质指数、收缩压、平均舒张压、吸烟饮酒史、既往病史等一般临床资料差异无统计学意义(P>0.05)，存在可比性(见表2)。其中37.7%的患者合并糖尿病；抽烟、饮酒多见于男性。

表2 三组基因型患者基础特征比较

2.3 三组基因型患者生化资料比较 三组患者的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、BUN、Cr、UA、HbA1c比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.4 三组基因型患者Hcy、叶酸、维生素B12水平比较 在122例高血压在患者中，纯合型(TT)的Hcy水平[(19.47±11.84) μmol/L]高于杂合型(CT)[(14.21±9.55) μmol/L]高于野生型(CC)[(13.02±6.15)μmol/L]，差异有统计学意义(P<0.05)。野生型的叶酸水平[(12.09±5.13)μg/L]高于杂合型[(10.52±4.97)μg/L]高于纯合型[(7.17±3.16)μg/L]，差异有统计学意义(P<0.01)。CC型的维生素B12水平[(409.25±221.05) pg/mL]高于CT型[(344.73±178.28) pg/mL]高于TT型[(268.54±101.80)pg/mL]，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 三组基因型患者Hcy、叶酸、维生素B12水平比较

2.5 MTHFR C677T基因多态性与血清Hcy水平的关系 同型半胱氨酸检测值正常者携带CC、CT、TT基因型频率分别为32.88%、46.57%、20.55%；MTHFR在高同型半胱氨酸患者基因型频率分别16.33%CC、38.77%CT、44.90%TT。高Hcy患者T等位基因频率明显高于正常Hcy患者，采用χ2检验比较，等位基因分布频率差异有统计学意义(P<0.01)，说明MTHFR C677T基因突变与Hcy升高存在一定的联系，MTHFR C→T突变导致Hcy水平上升。见表4。

表4 MTHFR基因多态性与血清Hcy浓度的关系[例(%)]

3 讨论

3.1 H型高血压是脑卒中的主要危险因素 我国脑卒中年龄标准化患病率、发病率和死亡率分别为1114.8/10万、246.8/10万和114.8/10万[4]，现状不容乐观。基于全国性的高血压调查显示，我国18岁及以上人口中高血压患病率有23%，患病人数约为2.445亿，正常高值血压的患病率为41.3%，患病人数约为4.353亿[5]。

高同型半胱氨酸血症和高血压作为脑卒中的独立危险因素，对脑卒中的形成具有协同作用[6-9]。在我国75%的成年高血压患者中伴有高同型半胱氨酸血症(HHcy)。血清Hcy水平升高，脑卒中发生风险增加，而Hcy水平下降则能降低脑卒中风险。2017年的中国脑卒中一级预防研究(CSPPT)后续分析显示，血清Hcy每下降20%，首发卒中的风险下降7%[10]。将伴有HHcy的高血压称为H型高血压。本研究共纳入122例高血压患者，H型高血压占72%。其中男性H型高血压的比例为78.02%，为71例，女性H型高血压比例为54.84%，为17例，男性H型高血压患病比例高于女性，可能与男性吸烟、饮酒率远高于女性有关。

3.2 MTHFR基因与同型半胱氨酸 高同型半胱氨酸水平与MTHFR基因突变有关[11-12]。吴子瑜等[13]研究表明纯合型血浆Hcy浓度显著高于杂合型和野生型(P值均<0.01)。本研究中MTHFR基因T等位基因的患者的Hcy水平远高于C等位基因患者，提示T等位基因与Hcy水平上升密切相关，与其他研究结果一致。

3.3 MTHFR C677T基因频率分布 MTHFR基因C677T位点突变频率在不同国家、不同地区及不同民族的分布有显著差异。Shiao等[14]的关于MTHFR基因多态性突变的研究发现西班牙裔的纯合突变频率是20%，东亚为18.24%，中东为13.77%，混合人口为12.02%，白人11.13%，非洲2.52%以及南亚1.86%。一项针对中国多个省份MTHFR C677T 位点突变频率的研究显示，MTHFR 677TT基因型和677T等位基因在中国健康人群中的频率分别为20%(18%～23%)和42%(38%～45%)[15]。本研究中男性患者基因型分布频率为21.98% CC、43.96% CT、34.07% TT，女性患者CC、CT、TT基因型频率为38.71% CC、41.94% CT、19.35% TT，同其他研究基因分布频率大致相同。但男性T等位基因频率与女性患者相比，差异有统计学意义，可能是由于纳入样本量过少导致。

3.4 MTHFR C677T基因多态性与H型高血压的治疗 本研究显示TT基因型患者叶酸和维生素B12水平均低于CT基因型和CC基因型患者，这一关于叶酸浓度的结果与Tsang等[16]评估亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)677C>T多态性与血液叶酸浓度之间的关联的分析结果一致，即CC>CT>TT。根据MTHFR基因多态性在临床针对H型高血压的治疗，在控制血压的同时补充叶酸很有必要。

本研究存在一定的局限性。本次实验样本量相对较少，仍需进行更大数据的临床研究，结果更具有代表性；本次实验是回顾性实验，如果将实验设置为前瞻性研究，可以对实验方案进行更精确的设计，结果更有价值。

4 总结

H型高血压是脑卒中的重要危险因素，MTHFR C677T基因多态性是H型高血压的重要遗传风险因素，且与Hcy、叶酸、维生素B12水平密切相关。对于高血压患者，建议进行MTHFR基因检测，可以根据MTHFR基因分型，进行危险分层，个体化补充叶酸、维生素B12，有助于高血压治疗。随着药物基因组学的发展和精准医疗的推进，基因导向个体化治疗的研究可以帮助合理用药，减少不良反应的发生，促进精准用药。