趋化因子CCL2对老年ST抬高型心肌梗死患者残余血小板活化的影响

曹禹，张慧慧，张桓，付营，李春辉，乔锐

北部战区总医院干部病房一科，沈阳 110016

急性心肌梗死(AMI)是冠心病中最危重的类型，也是心血管疾病致死的头号杀手[1]。AMI是在冠脉粥样硬化不稳定斑块破裂的基础上继发了血栓形成，导致冠脉闭塞引起心肌坏死。血小板聚集和激活功能的改变在斑块形成及斑块破裂形成血栓过程中具有重要作用[2]。临床上常用的抗血小板药物多数为单靶点药物，服用后仍能通过其他靶点通路引起血小板活化，治疗效果被减弱。老年AMI患者临床情况更为复杂，抗血小板治疗有效性更需关注[3]。新型抗血小板药物替格瑞洛为非前体药，不需要肝脏代谢，具有可与P2Y12 ADP受体可逆性结合，抑制血小板作用较强，可降低急性冠脉综合征(ACS)患者不良心血管事件风险等优势。但是，随着研究的不断深入，诸多研究证实ACS患者即使服用替格瑞洛，仍然不能避免血栓事件的发生[4-5]，说明仍有一定程度的残余血小板聚集和活化。因此，寻找参与残余血小板聚集和活化的关键调控分子至关重要。

趋化因子CCL2可由单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、心肌细胞等细胞分泌，是炎症反应中的启动因子，通过正反馈作用诱导其他炎症介质的产生和释放，加速动脉粥样硬化(AS)的进展[6]。CCL2在ACS的发生发展过程中同样具有重要作用[7-10]。本研究探讨CCL2对老年ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者服用替格瑞洛后残余血小板活化的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月至2019年6月于北部战区总医院收治的老年STEMI患者80例。所有入选患者年龄>60岁，均有典型胸痛症状，发病时间<12 h；心电图显示ST段呈弓背向上型抬高、异常Q波、T波倒置及动态演变过程；心肌酶学有动态变化；冠脉造影显示冠脉三支主要血管中有一处或多处狭窄超过75%。将近期患有严重肝肾疾病、肿瘤性疾病、先天性心脏病、心脏瓣膜疾病、自身免疫病、活动性炎症疾病、血流动力学不稳定、血液系统疾病、严重心力衰竭等疾病及既往行心脏冠脉相关手术的个体排除。

1.2 采集临床资料 入选患者均详细记录：入院时间、年龄、性别；常见危险因素：吸烟史、糖尿病病史、高血压病史；实验室检查：空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、脑尿钠肽(BNP)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌钙蛋白T(TnT)等。

1.3 样本的采集及分组 入选患者服用180 mg替格瑞洛，300 mg阿司匹林肠溶片。之后，分别于服药后2 h、4 h、6 h抽取患者的静脉血。每个时间点用含EDTA真空抗凝管采集3 mL静脉血；用Verifynow配套采血管采集2 mL静脉血。按照文献报道，依据Verifynow法检测P2Y12反应单位(P2Y12 reaction unit，PRU，代表残余血小板活性)数值不同将患者分为两组，PRU≥208为高反应组，PRU<208为正常反应组[11]。

1.4 ELISA检测血浆中CCL2水平 含EDTA真空抗凝管采集的静脉血，室温条件下3 000 r/min离心10 min，上清为血浆标本。将血浆标本分装至EP管中备用，每管100 μL左右。待检测血浆样本，加入等量RD6Q液稀释，充分混匀。反应板每孔先加入50 μL Diluent RD1-83液，再加入200 μL标准品或稀释后的待测样本，室温条件下孵育2 h。弃去液体，反应板每孔加入400 μL Wash Buffer液，洗3次后，将反应板倒置拍干。反应板每孔加入200 μL CCL2 Conjugate液，室温条件下孵育2 h。弃去液体，反应板每孔加入400 μL Wash Buffer液，洗3次后，将反应板倒置拍干。反应板每孔加入200μL Substrate Solution，室温条件下避光孵育30 min。反应板每孔加入50 μL Stop Solution，30 min内在酶标仪上检测吸光度(A)，通道选择450 nm。绘制标准曲线，并得出公式。将检测的每个样本的OD值代入公式，计算出每个待测样品的浓度。

1.5 Verifynow法检测P2Y12反应单位(PRU) Verifynow配套采血管采集的人静脉血于4 h内上机检测。Verifynow检测仪使用前预热15 min，电子质控PASS后，可以检测。打开检测仪顶盖，将测试卡插入仪器中，迅速并轻轻地颠倒血液样本，充分混匀，将血液样本采血管倒插入测试卡的检测针上，关上仪器顶盖，开始检测。3～5 min内显示PRU。

2 结果

2.1 服用替格瑞洛后2 h、4 h、6 h时，两组患者临床基线资料及PRU比较 服用替格瑞洛后2 h、4 h、6 h，正常反应组患者分别为49例、65例、68例；高反应组患者分别为31例、15例、12例，残余血小板高反应比例分别为38.8 %、18.8 %、17.7 %。服药后不同时间点，正常反应组和高反应组患者临床基线资料各指标比较，均差异无统计学意义(P>0.05)，见表1～3。

表1 服用替格瑞洛后2 h的STEMI患者基线资料

表2 服用替格瑞洛后4 h的STEMI患者基线资料

表3 服用替格瑞洛后6 h的STEMI患者基线资料

2.2 患者血浆中CCL2浓度的差异及其与PRU的相关性

2.2.1 正常反应组和高反应组患者血浆中CCL2的浓度差异 服药后2 h高反应组患者血浆中CCL2浓度[(212.10±88.81)pg/mL]明显高于正常反应组患者[(169.50±36.59)pg/mL]，P<0.01；服药后4 h高反应组患者血浆中CCL2浓度[(210.00±73.00)pg/mL]明显高于正常反应组患者[(161.60±40.76)pg/mL]，P<0.01；服药后6 h高反应组患者血浆中CCL2浓度[(200.00±48.57)pg/mL]明显高于正常反应组患者[(152.10±44.05)pg/mL]，P<0.01。

2.2.2 患者血浆中CCL2浓度与PRU的相关性 患者服药后不同时间点血浆中CCL2浓度与PRU之间均存在线性关系(r=0.463，r=0.622，r=0.413，P<0.01，图1)。

图1 服用替格瑞洛后不同时间点血浆中CCL2浓度与PRU的相关性：A为服药后2 h;B为服药后4 h;C为服药后6 h

3 讨论

AMI发病急，发病率和死亡率呈持续升高趋势，积极抗血小板治疗是目前主要的治疗手段之一[12]。然而，由于大部分抗血小板药物作用机制单一，无法完全拮抗血小板，引起残余血小板的再次活化和聚集，导致患者发生心脑血管不良事件[13-14]。本研究发现，选择80例服用替格瑞洛的老年STEMI患者，应用Verifynow法检测患者服药后2 h、4 h、6 h的PRU值，均有一定比例的残余血小板高反应。每个个体血小板反应性不尽相同，其发生心血管终点事件的概率和严重程度也不尽相同，具有血小板高反应性的个体更容易发生血小板聚集及激活，发生缺血性事件的概率也要明显高于血小板正常反应的个体[15]。可见，探寻调控血小板聚集和活化的关键因子尤为重要。

趋化因子具有广泛的生物学效应，可以维持造血环境的稳定，参与胚胎发育、血管新生及炎症免疫反应等多种生理和病理过程[16-17]。同样，趋化因子在血栓形成及血栓性疾病中也扮演重要角色[18-19]。血小板是构架血管炎症和血栓形成必不可少的成分。血小板与趋化因子之间存在着紧密的联系：血小板可以诱导血液中多种细胞释放趋化因子；在血小板诱导剂的作用下，趋化因子可以促进血小板聚集、活化和与内皮细胞黏附；激活的血小板可以释放趋化因子，这些趋化因子可以参与血管生成及脂质代谢等正常生理过程；黏附的血小板可与趋化因子相互结合促使循环中单核细胞到局部发挥作用[20]。

趋化因子CCL2除了具备趋化血液循环中的单核细胞至AS损伤部位，还可以作为始动因子诱导其他炎症因子和组织因子的产生和释放，促使AS的进展以及不稳定斑块破裂所致的血栓形成。我们前期研究发现，STEMI患者服用氯吡格雷4～6 h后，通过光比浊法检测患者残余血小板聚集率(RPA)，高反应组患者血浆中CCL2的浓度明显高于正常反应组，而且患者RPA与血浆中CCL2浓度存在线性相关[21]。本研究发现，80例服用替格瑞洛的老年STEMI患者服药后2 h、4 h、6 h，高反应组患者血浆中CCL2的浓度均显著高于正常反应组，各时间点血浆中CCL2浓度与PRU值之间均存在线性关系。而且，高反应组患者临床基线资料中各项指标均与正常反应组患者相匹配，与各时间点应用Verifynow法检测的患者PRU值及血浆中CCL2浓度均无相关性，说明PRU值与血浆中CCL2表达水平的相关性未受基线指标等因素的干扰，提示CCL2可能参与了残余血小板的活化和聚集，并为老年患者血栓事件的预防和治疗提供了新思路。