超高效液相色谱-串联质谱法检测2型糖尿病伴胰岛素抵抗患者血浆儿茶酚胺及其代谢物含量

刘岩，胡志飞，黄带发，李斯琪，刘兵，李红帅，刘艳霞

1.国家老年疾病临床研究中心 北部战区总医院老年医学中心干二科，沈阳 110016;2.杭州佰辰医学检验所有限公司

胰岛素靶器官或组织对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低就会发生全身或局部的胰岛素抵抗(IR)[1]。临床研究[2]发现，约25%的正常人群存在IR，糖耐量减低人群75%存在IR，2型糖尿病(T2DM)患者IR的发生率为85%左右。IR受多种因素影响，有多项研究发现胰岛素的分子结构功能异常、胰岛素的拮抗激素分泌过多、胰岛素受体的数量下降及结构功能受损等因素，都会影响胰岛素的生物活性以及与受体的结合从而导致IR的发生[3-4]。此外，如Glut4基因突变、葡萄糖激酶基因突变、某些微量元素缺乏如铬和钒缺乏、肿瘤坏死因子α(TNF-α)增多等也均易导致IR[5]。如何对IR进行有效监测和治疗，是IR预防与治疗面临的主要难题。

儿茶酚胺(CAs)是由肾上腺髓质和一些交感神经元嗜铬细胞分泌的一类重要的神经递质或激素物质，主要包括肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)等。应激状态下、长时间和大强度运动时，交感神经兴奋，机体血浆CAs的浓度会显著升高[6]。目前有研究[7]发现在与IR相关的疾病患者体内CAs类物质的含量显著高于健康人群，但是这些研究都存在着不少缺陷，临床样本数较少，且关于CAs检测方法的准确性、重现性、灵敏度和特异性还有待于进一步提高。本研究基于UPLC-MS/MS技术对血浆中CAs及其代谢产物进行定量测定，并进一步研究CAs及其代谢物与T2DM患者IR的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年10月至2020年10月在北部战区总医院就诊的T2DM伴IR患者105例(IR组)，同期健康对照者95例(CO组)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)知情同意并能遵守研究方案要求；(2)年龄>18岁。IR组：符合2018年ADA中T2DM诊断标准，稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)≥2.69。排除标准：(1)注射胰岛素或口服磺脲类药物者；(2)有肾上腺疾病者；(3)近3个月服用过影响CAs检测的药物(三环类抗抑郁药物、影响交感神经类药物、泼尼松、苯丙胺、单胺氧化酶抑制剂等)；(4)近3个月内心绞痛发作、肺部感染、严重心力衰竭、严重脑血管疾病、恶性肿瘤；急性消化道溃疡；酗酒者；(5)肝功能异常：谷丙转氨酶、谷草转氨酶均为正常值1.5倍以上；(6)肾功能异常：肌酐清除率<30 mL/min；(7)血白细胞计数<4.0×109/L，血小板计数<100×109/L，血红蛋白<90 g/L或有其他血液系统疾病者；(8)未控制的高血压(血压达到140/90 mmHg)及严重急性高血糖者；(9)精神病患者。

1.3 研究方法 测定体质指数(BMI)、收缩压、舒张压、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐清除率、血糖等基线资料。采用UPLC-MS/MS法检测患者血浆中CAs及其代谢物[DA、E、NE、变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)、高香草酸(HVA)、香草扁桃酸(VMA)]的浓度范围、精密度、回收率等。

1.4 主要仪器与试剂 超高效液相色谱仪(美国，Waters)；ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD三重四极杆质谱仪(美国，Waters)；CV100-DNA真空离心浓缩仪(中国，北京吉艾姆)，儿茶酚胺及儿茶酚胺代谢产物样本释放剂(中国，杭州佰勤医疗器械有限公司)，色谱甲醇(美国，Merck)，色谱乙腈(美国，Merck)，甲酸(中国，阿拉丁)，乙酸铵(中国，麦克林)。

1.5 标准曲线样本制备 准确称取标准品DA、NE、E、MN、NMN、HVA、VMA分别配制成1 mg/mL母液；混合并稀释得到不同浓度的溶剂标准曲线样本，浓度范围在1.1～326.49 nmol/L之间，然后各取25 μL溶剂标准曲线样本，对应加入225 μL儿茶基质液，得到一系列标准曲线样本250 μL，测定浓度并绘制曲线，浓度(x)为横坐标，峰面积比值(y)为纵坐标，根据线性方程式，获得R值均大于0.99，结果呈良好的线性关系，且具有很宽的线性范围，可以更好地满足临床应用需求，见图1。

1.6 LC-MS/MS条件 (1)色谱柱：BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；(2)流动相：0.1%甲酸-10 mM乙酸铵溶液(A相)和0.1%甲酸-乙腈溶液(B相)；(3)梯度洗脱;(4)进样量及质谱检测参数：10 μL；柱温：40 ℃；(5)质谱条件：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)；毛细管(Capillary)：3.2 kV，锥(Cone)：50 V，去溶剂温度(Desolvation Temp)500 ℃，去溶剂(Desolvation)：900 L/Hr，各化合物的母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，见表1。

表1 质谱检测参数

1.7 精密度与加标回收率 本研究检测指标定量下限在0.11～0.15 nmol/L，批内和批间精密度即变异系数(CV)均在15%以内，加标测试平均回收率在88%～105%，符合临床检测方法学准确定量标准，见表2。检测方法中无须使用固相萃取板，成本较低，可同时检测包括CAs(DA、NE、E)和其中间产物(NMN、MN)以及代谢终产物(HVA、VMA)在内共7个指标，能充分满足临床实际应用中需同时准确定量儿茶酚胺相关指标的要求。

表2 批内、批间精密度和加标回收率数据

注：VMA为香草扁桃酸；HVA为高香草酸；MN为变肾上腺素；NMN为去甲变肾上腺素；NE为去甲肾上腺素；E为肾上腺素；DA为多巴胺。

2 结果

2.1 两组患者一般情况比较 两组平均收缩压、舒张压、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐清除率等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，IR组BMI明显高于CO组，差异有统计学意义(P<0.05)，IR组血糖明显高于CO组，差异有统计学意义(P<0.05)，IR组平均血糖为(7.37±1.23)mmol/L，见表3。

表3 两组一般临床资料对比

2.2 两组受试者CAs及代谢物水平比较 IR组E、NE、MN、NMN、HVA、VMA较CO组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。IR组DA水平较CO组有升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 两组CAs及其代谢产物比较

3 讨论

IR患者为维持正常血糖，反馈性刺激胰岛素分泌增加，高胰岛素血症可使交感神经活性增高[8]。若交感神经兴奋时间较长，可促进CAs及其代谢产物的合成[9]。近年来关于IR方面的研究主要基于糖尿病本身或侧重于CAs的监测[10-11]，CAs作为评价人体交感神经功能的重要指标，其检测的准确性尤为重要。目前临床常规CAs检测的方法主要是免疫法，包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫法(CLIA)，均存在不同程度的缺点，如灵敏度低、重现性差、特异性差、要求样本量多等。UPLC-MS/MS法灵敏度高、特异性强、准确度高、分析时间短、能同时分析多组分混合物，已逐渐成为国际上包括CAs在内的小分子水平检测的主流技术[12]。国内外应用UPLC-MS/MS技术评估CAs水平的研究还多限于科学研究，真正用串联质谱法检测人体内CAs与临床疾病的相关性研究还相对较少。本研究应用串联质谱法检测患者血浆中CAs(DA、E、NE)及其代谢产物(MN，NMN，HVA，VMA)浓度范围在1.1～326.49 nmol/L之间，线性关系良好。各指标定量下限在0.11～0.15 nmol/L，批内和批间精密度测试结果CV均在15%以内，加标测试平均回收率在88%～105%内，符合临床检测方法学准确定量标准。检测方法中无须使用固相萃取板，成本较低，可同时检测包括CAs(DA、NE、E)和其中间产物(NMN、MN)以及代谢终产物(HVA、VMA)在内的7个指标，能充分满足临床实际应用中需同时准确定量CAs相关指标的要求，结果更为准确，适合临床推广。

人体CAs水平会受到不同因素的影响，尤其是年龄、性别、血压等[13]。在本研究中，两组研究对象在年龄、性别、血压控制等方面差异无统计学意义(P>0.05)，排除了混杂因素的影响。有研究[7]表明CAs参与急性期血糖的调节，包括刺激肾葡萄糖释放、抑制胰岛素分泌、刺激胰高糖素分泌增加、糖异生，底物供应刺激脂解和降低组织葡萄糖摄取有关。本研究中IR组血糖较CO组明显增高(P<0.05)，但IR组平均血糖为(7.96±1.04)mmol/L，未有严重急性期高血糖，排除了急性期高血糖对CAs的影响。有研究[14]表明BMI与IR抗之间存在密切相关性，肥胖人群更容易发生IR，本研究中IR组BMI明显高于CO组，差异有统计学意义，与相关报道相符。

CAs主要来源于交感神经末梢和肾上腺髓质，这两个部位均会产生NE，而E仅产生于肾上腺髓质；糖尿病伴IR患者可能出现肾上腺髓质交感神经通路异常，伴随着CAs水平的异常[15]，IR常伴随着反调节胰岛素激素(皮质醇、生长激素、CAs)分泌过多，而抑制体内CAs水平，从而降低交感神经活性，改善IR[16]。本研究中T2DM伴IR患者血浆CAs(NE和E)及CA s代谢产物(MN、NMN、HVA和VMA)水平明显高于健康对照者，与相关报道[17]一致。

DA是脑内一种重要的神经递质，中脑黑质致密部的DA神经元投射至背侧纹状体调控躯体运动，中脑腹侧被盖区DA神经元投射至腹侧纹状体，参与情绪、动机及奖赏行为的调节[18]。IR使外周血胰岛素水平升高，外周胰岛素可通过其转运体穿过血脑屏障进入中枢，接受胰岛素刺激后DA分泌显著增加[19]。但长期的IR，神经细胞也可对胰岛素产生抵抗，中脑DA合成降低，导致DA释放减少[20]。且DA的水平受多种因素影响，有报道[21]长期高脂饮食可引起中脑DA合成降低，运动可提高DA的释放，改善IR。本研究中IR组DA水平较CO组有所升高，但差异无统计学意义。这可能与入组患者体质指数为(25.25±2.39)kg/m2，非严重肥胖，以及上述饮食、运动等多种因素的影响有关，有待于扩大样本数量，进一步研究。

综上所述，UPLC-MS/MS法检测CAs及其代谢物具有简单、准确、特异性高等优点。T2DM伴IR患者中，血浆CAs及其代谢产物NE、E、MN、NMN、HVA和VMA含量较健康人显著升高；可通过改善患者体内NE和E水平，抑制交感神经活性，起到改善IR的作用。