三种贝类不同部位维生素D3的分布及含量比较研究

张肖瑕，刘欣妍，许 艳，贾 喆，宋 茹

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022）

维生素D是重要的脂溶性维生素之一，它分为维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇），维生素D2主要来源于植物、真菌、某些无脊椎动物［1］，维生素D3主要来源于动物，如水产动物体、鱼类、动物肝脏、蛋类等［2］。维生素D可调节机体对钙磷的代谢，提高人体免疫功能的作用［3］，缺乏维生素D导致儿童产生佝偻病，成人引起软骨病及其他症状［4，5］。维生素D3（Vitamin D3），分子式C27H44O，由于维生素D3与阳光有直接关系，所以又称为“阳光维生素”［6］。David等［7］报道澳洲肺鱼维生素D3含量达到10.7μg/100 g，大西洋鲑鱼维生素D3含量5.8 μg/100 g。目前国内对于贝类中维生素D3的分布及含量鲜见报道。本研究以白蛤、花蛤和青蛤3种不同贝类（图1）为研究对象，分别提取蛤肉和内脏维生素D3，对3种贝类维生素D3的分布及含量进行比较研究，旨在为后续贝类维生素D3的活性研究及综合利用奠定基础。

图1 3种贝类

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 新鲜活白蛤、花蛤、青蛤于2019年12月购自舟山市定海区华润万家超市，冻藏备用；考马斯亮蓝G-250、分析级石油醚（30～60℃沸程）、甲醇均购于国药集团；色谱级无水甲醇购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；维生素D3标准品（纯度98%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要试验设备 TM-767搅拌机，中山市海盘电器有限公司；Thermo He高速冷冻离心机，赛默飞世科技有限公司；SHA-B型双功能水浴恒温振荡器，金坛市岸头良友实验仪器厂；Vortex QL-861漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器有限公司；EYELA MGS-2200氮吹仪，上海五久自动化设备有限公司；SM800酶标仪，上海永创医疗器械有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，德国安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 维生素D3的提取 冷冻贝类用流动水解冻，手动分别剥取蛤肉和内脏，绞碎，蛤肉和内脏样品取适量，分置于50 mL离心管中，按照1∶2（m∶V）比例加入（30～60℃沸程）石油醚，根据样液体积加入抗坏血酸（终浓度为0.012 5%），37℃水浴振荡（200 r/min），避光提取3 h，然后7 500 r/min离心15 min（4℃），取石油醚萃取层，氮气吹干，加入无水甲醇复溶，涡旋振荡至充分溶解，然后定容至2 mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液备用。

1.2.2 总维生素D3含量的测定 参照Sazali等［8］高效液相色谱法测定维生素D3含量，具体条件如下。色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温40℃，进样量10μL，流动相为100%甲醇，流速0.6 mL/min，检测波长264 nm。在相同条件下，测定不同浓度维生素D3标准品（0.1、0.5、1、2、6、10μg/mL）洗脱情况，以维生素D3浓度为横坐标（μg/mL），峰面积为纵坐标，绘制维生素D3标准曲线。样品峰面积带入维生素D3标准曲线，计算出样品中维生素D3浓度（μg/mL），根据式（1）计算样品中维生素D3含量。

式中，c为提取液中维生素D3浓度，μg/mL；v为提取液体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.3 蛋白质定性及含量测定 考马斯亮蓝G-250染色液呈蓝绿色，与蛋白质分子中的酰胺基通过分子间范德华键结合，使溶液变为蓝色［9，10］，常用于蛋白质的定性及定量分析。样品液与考马斯亮蓝G-250试剂按照1∶5比例混合，充分反应15 min，测定595 nm处吸光度。不同浓度牛血清白蛋白（0～400 μg/mL）与考马斯亮蓝试剂反应后，测定595 nm处吸光度，以蛋白质浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），绘制出蛋白质标准曲线y=0.001 5x+0.040 3，R2=0.920 7，用于样品提取液中蛋白质浓度测定。

1.3 数据统计

试验结果用平均值±标准差（n=3）表示，采用Origin 2019软件绘制图形，用SPSS 19.0软件对组间差异性进行比较。

2 结果与分析

2.1 维生素D3标准曲线制作

图2结果表明，在0～10μg/mL维生素D3浓度与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为y=28.557x+4.339 2，R2=0.998 9，可用于本试验提取液中维生素D3浓度测定。

图2 维生素D3标准曲线

2.2 贝类不同部位维生素D 3分布及含量比较

2.2.1 不同蛤肉中维生素D3分布比较 白蛤、花蛤、青蛤的蛤肉中维生素D3分布情况见图3。维生素D3标准品在洗脱时间19 min出现特征吸收峰，根据洗脱时间来定性。由图3可知，白蛤肉在18.5 min有特征吸收峰，花蛤肉和青蛤肉均在18.6 min处有特征吸收峰出现（箭头所示），但同时也能看出，蛤肉除了在18.5～18.6 min处有特征吸收外，在其他时间段也出现264 nm特征吸收峰，推测可能与提取液中含有蛋白质、肽、维生素D3衍生物及其他复合产物有关，有待于进一步研究。由图3还可以看出，3种贝类的蛤肉在17～25 min出峰时间比较类似，表明3种贝类除了含有维生素D3外，还可能含有其他类似物。

2.2.2 不同蛤内脏中维生素D3分布比较 白蛤、花蛤、青蛤的蛤内脏中维生素D3分布比较见图4。由图4可以看出，白蛤内脏、花蛤内脏、青蛤内脏均在18.7 min出现特征吸收（箭头所示），说明含有维生素D3。与蛤肉的色谱图相似，3种贝类内脏提取液同样在其他时间段也出现类似吸收峰，说明这3种贝类内脏提取液中含有大量类似物。

2.2.3 3种贝类提取液中蛋白质定性和定量分析维生素D3在264 nm处有特征吸收［8］，蛋白质中肽键、酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸在220～280 nm也有吸收［11］。对3种贝类肉和内脏提取液中蛋白质进行定性和定量分析，结果见图5。由图5可知，3种贝类肉和内脏提取液中均含有蛋白质，即考马斯亮蓝溶液被染色呈蓝色，说明图3和图4分离的色谱峰中含有蛋白质类物质存在。进一步对3种贝类肉和内脏提取液的蛋白质浓度进行定量分析，花蛤肉提取液中蛋白质浓度达到519.20μg/mL，显著高于白蛤肉和青蛤肉中蛋白质浓度（P＜0.05）。而3种贝类内脏提取液中，花蛤内脏蛋白质浓度显著高于白蛤和花蛤内脏提取液的蛋白质浓度（P＜0.05）。由此可见，3种贝类肉和内脏提取液中蛋白质浓度不同。推测该部分蛋白质可能具有较强的疏水性或与脂类结合在一起，结果被石油醚萃取出来。因此，这3种贝类肉和内脏提取液的维生素D3纯化后续需要经过脱蛋白处理。

图4 不同蛤内脏中维生素D3分布比较

图5 3种贝类提取液的蛋白质定性及定量分析

2.2.4 不同蛤肉和内脏维生素D3含量比较 进一步比较了3种贝类的蛤肉和内脏维生素D3含量及维生素D3总量，结果见图6。由图6（a）可以看出，白蛤肉中维生素D3含量显著低于花蛤肉维生素D3含量（P＜0.05），花蛤肉维生素D3含量高达到10.90±0.74 μg/g。而在内脏中，花蛤内脏的维生素D3含量显著高于白蛤和青蛤内脏中维生素D3含量，其中青蛤内脏维生素D3含量最低为2.10±0.24μg/g。此外，图6（a）结果显示白蛤肉和内脏的维生素D3含量无统计学上差异，而花蛤和青蛤肉中维生素D3含量均显著高于其内脏维生素D3含量。

比较图6（b）维生素D3总量可知，花蛤的维生素D3总量最高，达到19.30±0.72μg/g，比青蛤维生素D3总量高出3倍。Bourre等［12］报道，贝类牡蛎中维生素D3含量达8.0 mg/100 g，William等［13］报道，海鲈鱼中维生素D3含量为0.73 mg/100 g。本研究中白蛤、花蛤和青蛤的维生素D3总量与文献报道的水产品维生素D3含量范围具有一致性。

图6 3种贝类维生素D3含量比较

3 结论

3种贝类肉和内脏中均含有维生素D3，但是含量差异较大，其中花蛤内脏及肉中维生素D3含量最高，青蛤维生素D3总量最低。高效液相色谱法及蛋白质定性和定量分析表明，3种贝类提取液中除了含有维生素D3外，还有蛋白质等其他干扰物质，因此从贝类提取维生素D3需要进一步纯化处理，其他洗脱峰的特性也需要深入研究，为后续维生素D3的活性及应用研究奠定基础。