牛肉、牛奶中可的松和氢化可的松含量分析

杨 奕，尹 杰，杨蕴嘉，张 晶

（北京市疾病预防控制中心，北京市预防医学研究中心，北京 100013）

激素类物质是调节机体正常生长、发育、生殖等重要生命活动的关键生物活性成分。根据化学结构的不同，激素可分为肽类、氨基酸类、胺类和类固醇类。类固醇类激素又包括肾上腺皮质激素（皮质醇、醛固酮等）和性激素（雌激素、孕激素及雄激素等）。在动物食品安全领域，激素类药物的残留是消费者最为关注的议题；另一方面，动物组织中会天然存在一些自身细胞合成和分泌、调节生理活动的内源性激素物质，如同属于糖皮质激素的氢化可的松和可的松[1-3]。GB 31650—2019《食品中兽药最大残留限量》规定可的松可以在马、牛、猪、羊4 种动物的饲养过程中使用，氢化可的松可以在所有动物饲养中使用但仅限于外用，并且可的松和氢化可的松均不需要制定最大残留限量[4]。然而，欧盟和加拿大规定牛奶和羊奶中氢化可的松的残留限量为10 µg/kg[5-6]。在我国的进出口食品国际贸易中，食品中农兽药法规限量的差异可能导致食品退运等问题，给我国食品出口企业带来了沉重的经济负担[7-9]。有研究表明，尽管皮质醇激素在生物体的正常生理活动中起到重要的调节作用，但是长期大剂量地使用皮质醇激素会导致骨质疏松、高血压、肥胖、急性心肌梗死、感染等不良反应[10-12]。因此，开展可的松和氢化可的松在主要食品中的含量水平研究，获得这2 种化合物在牛奶等动物性食品中的存在水平，不仅对于保护消费者健康具有重要意义，同时也对我国农产品国际贸易具有重要的价值[13-15]。

现有国内外文献中，有关激素类药物的检测技术报道较多[16-27]，部分文献也涉及到可的松和氢化可的松，但是这些研究多集中于分析方法本身，样本监测相对较少。Ma Lili等[28]检测发现牛奶中氢化可的松的含量水平在2 µg/kg以下；Chiesa等[29]分析了原料乳样品中多种激素的含量，得到可的松和氢化可的松的平均值分别为1.06 µg/L和2.56 µg/L。但是，以上研究均存在样本量少等问题，不足以获得动物体内内源性激素含量水平的阈值[30]。此外，由于不同产地牛在养殖过程中投喂的饲料不同，且饲养习惯也有所差异，可能会导致牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松含量不同。因此，本研究拟通过大量样本采集，分析市售牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松的含量水平，初步获得两类产品中可的松和氢化可的松的含量范围，对不同产地的牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松含量进行分析，旨在为动物性食品的安全保障提供技术支持及数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

可的松、氢化可的松、同位素内标氢化可的松-D3德国Dr. Ehrenstoffer公司；甲酸、乙酸、乙酸钠（均为分析纯） 美国百灵威公司；甲醇、乙腈（均为色谱级）美国Fisher公司；β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液美国罗氏公司；其他试剂均为国产分析纯；石墨化碳黑固相萃取柱（ENVI-CarbTM） 安谱集团有限公司；氨基固相萃取柱、Acquity UPLC超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱仪 美国Waters公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

试样中的目标化合物检测采用GB/T 21891—2008《动物源性食品中的激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》，主要步骤如下：称取样品5 g（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中。准确加入100 µg/L氢化可的松-D3溶液100 µL和10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，混匀后再加入100 µL葡萄糖酸苷肽酶/磺酸酯酶溶液于37 ℃水浴摇床中酶解过夜，取出后再加入25 mL甲醇，超声提取30 min。提取液ENVI-Carb固相萃取柱和氨基柱净化，洗脱液并在微弱的氮气流下吹干，用1 mL甲醇-水（50∶50，V/V）溶解残渣上机测定。液相色谱串联质谱仪器方法参数均参考GB/T 21891—2008。

1.2.2 方法学验证

配制系列混合标准溶液，质量浓度分别为0、0.5、1、2.5、5、10、20、50 µg/L和100 µg/L，均含有氢化可的松-D3同位素内标各10 µg/L。经液相色谱-串联质谱测定，以目标化合物的定量离子峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，待测组分的质量浓度为横坐标，绘制内标工作曲线。

在均质的空白样品中加入适量混合标准溶液，使样品中可的松、氢化可的松的加标量分别为0.1、1 µg/kg和5 µg/kg，内标氢化可的松-D3均为2 µg/kg。每个水平设6 个平行，计算目标化合物的回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.3 样品收集

采用方便抽样的方法，在我国不同区域的城市超市、农贸市场等地采集市售牛肉、牛奶样品。所有样品采集后立即运往实验室，-20 ℃冷冻保存。

1.3 数据统计

应用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，统计分析前所有计量资料经正态性检验判断是否符合正态分布。对于符合正态分布的数据，以描述；不符合正态分布的数据，用最大值、平均值、中位数和95百分数（P95）进行统计描述。采用Spearman秩相关性分析法对样品中可的松和氢化可的松含量相关性进行分析。P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 方法学验证结果

对检测方法开展实验室内方法确证。结果表明，可的松和氢化可的松均在0.5～100 µg/L内呈良好的线性，相关系数r2大于0.999 3。2 种目标化合物的检出限均为0.04 µg/kg，定量限均为0.1 µg/kg（表1）。3 个加标水平下，可的松和氢化可的松的回收率在83.6%～113.5%之间，RSD为2.4%～10.5%，表明该方法具有良好的线性、准确度和精密度。

表1 可的松和氢化可的松的线性范围、检出限和定量限Table 1 Calibration equation, LOD and LOQ for corstione and cortisol

2.2 样品收集

本研究从浙江、湖南、山东、黑龙江、云南、陕西、四川、北京、宁夏等省、市、自治区的超市、农贸市场采集牛肉样品188 件和牛奶样品158 件，共计346 件样品。如图1所示，采样地点涵盖了我国东北、华北、华东、西北、西南以及华中地区6大地理区域，具有一定代表性。此外，对本研究采集的346 件样品的产地进行分析，牛肉和牛奶的产地除了采集地以外，还涉及河北、安徽等地。

图1 牛肉和牛奶样品采集地和产地分布图Fig. 1 Regional distribution of of beef and milk samples collected in this study

2.3 可的松和氢化可的松含量水平分析

采用液相色谱-串联质谱法检测346 件牛肉和牛奶样本中可的松和氢化可的松的含量，将所有检测结果小于检出限视为未检出，发现牛肉和牛奶中可的松的检出率分别为88.8%和86.1%，氢化可的松的检出率分别为99.5%和100%。参照世界卫生组织有关膳食中污染物含量的统计方法[31]，在数据分析中对测定结果小于定量限的样本按照0.5 倍定量限（0.05 µg/kg）进行赋值，对测定结果小于检出限的样本按照0.5 倍检出限（0.02 µg/kg）进行赋值。

利用Shapiro-Wilk检验（W检验）方法对赋值后的牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松的含量进行正态性检验，结果如表2所示。牛肉中可的松和氢化可的松，以及牛奶中可的松含量正态性检验的P值均小于0.05，呈非正态分布；而牛奶中氢化可的松含量的正态性检验的P值大于0.05，呈正态分布。因此，本研究对牛肉中可的松和氢化可的松，以及牛奶中可的松含量的统计描述采用最大值、平均值、中位数和P95；对牛奶中氢化可的松含量的统计描述除采用上述指标外，还计算了标准差。

表2 牛肉和牛奶中可的松、氢化可的松含量的Shapiro-Wilk检验结果Table 2 Results of Shapiro-Wilk test of cortisone and cortisol contents in beef and milk

如表3所示，在188 件牛肉样品中可的松含量的最大值为12.71 µg/kg，最小值为0.02 µg/kg，其平均值和中位值分别为1.69 µg/kg和1.14 µg/kg，P95为5.15 µg/kg。牛肉中氢化可的松含量在0.02～74.88 µg/kg之间，其平均值和中位值分别为12.16 µg/kg和8.14 µg/kg，P95为34.18 µg/kg。牛奶中可的松最高含量为1.80 µg/kg，最低含量为0.02 µg/kg，其平均值和中位值均为0.23 µg/kg，P95为0.40 µg/kg。然而，对于牛奶中的氢化可的松而言，由于其浓度值符合正态分布，因此用均值和标准偏差对其进行统计描述。结果表明，牛奶中氢化可的松含量为（0.72±0.35） µg/kg，P95为1.31 µg/kg。

表3 牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松的含量水平Table 3 Cortiaone and cortisol contents in beef and milk samples µg/kg

由于激素是生物体内天然存在的物质，具有多种生理功能与生长发育密切相关，因此肉和奶等动物性食品中通常会含有一定量的皮质醇激素等内源性激素[21-25]。Ma Lili等[28]利用液相色谱-串联质谱方法检测牛奶中12 种皮质醇激素，在10 份牛奶样本中只检测到了氢化可的松，其含量为0.69～1.82 µg/kg。在另一项研究中，Chiesa等[29]分析了50 份牛奶样品种多种激素的含量，得到可的松和氢化可的松在牛奶中含量的平均值分别为1.06 µg/L和2.56 µg/L。Goyon等[32]监测了来自荷兰3 家农场的多份牛奶样品，发现产自荷兰的牛奶中可的松和氢化可的松含量平均值分别为112 ng/kg和235 ng/kg。在本课题组前期的研究中，测定了牛肉、鸡肉等可食用肌肉组织中可的松和氢化可的松含量为0.3～14.7 µg/kg[19]。通过比较发现，本研究测得的牛肉和牛奶中可的松、氢化可的松的含量水平与文献报道的结果相当。

2.4 不同产地牛肉和牛奶中可的松、氢化可的松含量水平

本研究对不同产地的牛肉和牛奶中可的松、氢化可的松的含量水平进行了比较。188 份牛肉样品的产地来自于安徽、北京、河北、黑龙江、湖南、内蒙古、宁夏、山东、陕西、上海、四川、云南和浙江13 个省市自治区，其中安徽、北京、上海、河北、陕西和浙江6 产地的样本量均小于10，不再纳入统计分析。同样的，158 份牛奶样品也来自安徽、北京、广东等12 个省市自治区，其中安徽、广东、江苏、河北、内蒙古、宁夏以及天津产地的样本量均小于10，不再纳入统计分析。从图2可以看出，不同产地牛肉样品中可的松含量的平均值在0.29～3.44 μg/kg之间，中位数在0.02～2.87 µg/kg之间，氢化可的松含量平均值在5.94～0.33 µg/kg之间，中位数为5.58～16.68 µg/kg。不同产地牛奶中可的松含量平均值在0.13～0.32 µg/kg之间，中位数为0.15～0.31 µg/kg；氢化可的松含量平均值在0.43～1.07 µg/kg之间，中位数为0.46～1.06 µg/kg。从图2可以看出，不同产地的牛肉、牛奶中可的松和氢化可的松的含量水平存在一定差异，提示地理环境因素可能会对肉牛和乳牛的激素分泌产生影响。但是由于本研究不同产地的样本数量不完全一致，且未考虑品种、牛龄、采样时间等因素的影响，因此目标化合物浓度水平与样品产地的关系需要进一步研究。

图2 不同产地牛肉和牛奶中可的松、氢化可的松的含量分布Fig. 2 Distribution of cortisone and cortisol in beef and milk from different regions

2.5 可的松和氢化可的松含量相关性分析

利用相关性检验考察样品中2 种目标化合物含量的相关性，计算2 种化合物含量的比值。分析结果显示，牛肉和牛奶中可的松和氢化可的松的含量均呈显著正相关（图3），相关系数分别为0.735（P＜0.001）和0.809（P＜0.001）。牛肉中氢化可的松与可的松的含量比值范围为1.0～44.5，平均值为8.58，中位数为7.05。牛奶中氢化可的松与可的松含量比值的范围为1.1～25.4，平均值为4.33，中位数为3.40。上述结果表明，2 种内源性激素在肉牛和乳牛体内可能具有相同的合成、分泌和代谢途径。

图3 牛肉（A）和牛奶（B）中可的松和氢化可的松相关性Fig. 3 Correlations between cortisone and cortisol contents in beef (A) and milk (B)

3 结 论

本研究采用液相色谱-串联质谱检测方法分析采自我国9 个省、市、自治区的346 份牛肉和牛奶样品中可的松和氢化可的松的含量水平。在牛肉和牛奶样品中可的松和氢化可的松普遍检出，检出率均超过80%，可的松和氢化可的松的含量水平均小于100 µg/kg，且存在一定的地域差异。牛肉中可的松和氢化可的松，以及牛奶中可的松含量呈非正态分布，中位值分别为1.14、8.14 µg/kg和0.23 µg/kg。牛奶中的氢化可的松含量呈正态分布，其含量平均值为（0.72±0.35） µg/kg。以含量的P95评估牛肉可的松和氢化可的松含量范围分别为小于5.15 µg/kg和34.18 µg/kg，牛奶可的松和氢化可的松含量范围分别为小于0.40 µg/kg和1.31 µg/kg。此外，相关性检验分析结果表明牛肉和牛奶2 类样品中可的松和氢化可的松的含量均呈显著正相关，为食品中激素残留的科学监管提供了新思路。