气相色谱-质谱联机结合感官分析共建樱桃香气关联网络

邱 爽，唐 飞，刘 畅，谢美林，魏阳吉,*，李景明,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中化现代农业有限公司，北京 100031）

风味是食品的重要特征，由香、味、感组成，其中香气最为重要。食品香气是指食品各种风味物质中一小部分具有致香活性的物质[1]，尤其在水果中，尽管香气仅占水果鲜质量的0.01%～0.001%，但它们是构成和影响水果鲜食及加工品品质的重要因素，也是吸引消费者和巩固市场的关键[2-3]。

香气物质的分析方法包括感官分析与仪器分析。感官分析可以从视觉、嗅觉、味觉进行分析，作出综合评价，具有简单、直接、可描述的特点[4-5]，但也具有成本高、主观性强、重现性差、不适于分析大量样本的缺点[6-7]。香气研究的仪器分析法中气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法因灵敏度高、可重复，是香气研究的主要手段。但是GC-MS作为一种间接的分析手段无法得知某种香气物质对整体香气的贡献大小，且其结果不能可视化，具有不可感知的缺点[8]。因此在食品香气研究中，如何将感官分析与仪器分析协调融合，是香气研究领域的热点问题。气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）从仪器研发角度探索现代仪器分析与感官相结合的方法，并成功发现了一些含量微弱但感知阈值很低的香气成分，还检测到了一些难挥发性香气物质[9]，电子鼻将传感器引入香气成分分析，对采集到的气敏型信号进行数学分析，以求模拟人类对气味的认知。随后有大量研究针对香气成分GC-MS联机鉴定结果进行数学分析，以求实现模式判别[10-12]。如Petronilho等[13]对葡萄酒的挥发性成分进行了全面测定，利用不同提取技术和GC分析相结合建立了由2 个不同节点组成的基于二部网络的方法，一个节点包含19 个香气描述符，另一个节点包含相应的挥发性化合物。但电子鼻及GC-MS联机结果的数学分析等研究成果，大都具有脱离实际食品香气感官特征的缺陷。如何将真实的食品感官特征性感受与GC-MS联机结果衔接，确定二者关联性，以GC-MS联机分析替代或部分替代感官品评，是非常值得探讨的方向。

樱桃属蔷薇科，李属类植物，在世界各地广泛种植[14]，有“早春第一果”的佳誉。樱桃具有极高的营养价值[15-16]，更以香气浓郁著称，其香气特性在国内外受到普遍关注和研究报道[17-19]。樱桃中的风味物质主要有醛类、醇类、酮类、酸类、酯类以及萜烯类化合物[3,20]。Mattheis等[21]采用动态顶空法从‘Bing’甜樱桃中检测出28 种香气成分，主要为2-丙醇、苯甲醛、己醛。Girard[19]、Bernalte[22]等对一些欧美樱桃品种的香气成分进行了研究，除上述特征香气外，发现(E)-2-己烯醛、(E)-2-己烯-1-醇也是甜樱桃果实中最重要的香气成分。Petersen等[23]采用溶剂萃取法对酸樱桃的香气成分进行了研究，将香兰素和丁子香酚补充到樱桃重要香气成分中。Wen Yaqin[17]、Sun Shuyang[24]等对不同樱桃品种的香气成分进行了测定，结果表明不同樱桃品种的香气特征相似，但这些香气化合物对每种樱桃的贡献存在显著差异。所以只有明确樱桃产品的香气特征才能更好地完善产品风味与质量。本实验在此背景下，以香气感官特征鲜明的水果樱桃为实验材料，采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）联合GC-MS技术对樱桃香气成分进行测定，并进行香气感官品评，利用Pearson分析建立香气感官品评与GC-MS结果间的关联网络，旨在为食品香气研究中GC-MS分析替代感官品评提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9 个不同品种樱桃（品种信息见表1）由山东省烟台市福山区烟台锦程大樱桃种植基地（37°26’38”N，121°16’0.3”E）提供，该地区属低山丘陵区，土壤以棕壤土为主，土层深厚、疏松、保水保肥力强，气候属温暖半湿润易旱区，气候温和、四季分明，适合樱桃的生长。樱桃采收时间为2019年5月下旬，采样方式为随机取样法，随机选择6 个生长一致的樱桃植株作为样株，按照商业成熟标准，从样株的外围随机采果5 kg，采后用保鲜盒盛装，用带有冰袋的保温箱24 h内运输至实验室。样品到达实验室后，24 h内及时开展感官品评，同时从中挑选1 kg健康、成熟度一致、大小一致的果实，液氮快速冷冻后，于-40 ℃贮存待分析。

表1 樱桃样品信息汇总Table 1 Information about cherry samples tested in this study

正构烷烃C7～C40、乙醇、甲醇（均为色谱纯）上海安普实验科技有限公司；碳酸钠、氯化钠、无水乙醇、交联聚乙烯吡咯烷酮、D-葡萄糖酸内酯 北京百灵威科技有限公司；2-壬酮（色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

GL-20G-II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；BSA124S-CW分析天平 德国塞利多斯公司；RZ-708H干磨料理机 荣事达公司；7890B型色谱仪、5977B型质谱、HP-5MS毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS分析

1.3.1.1 样品制备

参照Chen Kai等[25]的方法。从-40 ℃的冰箱中取樱桃若干，液氮环境下去核初破碎，称取约30 g樱桃，加入0.60 g交联聚乙烯吡咯烷酮，0.30 gD-葡萄糖酸内酯，破碎机破碎成粉末状，随后迅速转移至50 mL离心管中置于4 ℃冰箱保存4 h。4 h后取出样品，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.3.1.2 HS-SPME

取5 mL澄清樱桃汁，加入10 μL 2-壬酮（8.22 mg/L）作为内标物、1 g NaCl和磁力转子置于20 mL顶空瓶中，加盖密封后置于磁力搅拌台上，40 ℃平衡30 min，待气液两相达到平衡后，将老化后的长度为2 cm、厚度为50/30 μm的DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶置于液面上方1 cm处，40 ℃吸附30 min，然后将SPME萃取头拔出插入GC-MS进样口，250 ℃热解吸8 min。

1.3.1.3 GC-MS分析

参考Wen Yaqin等[17]的方法，并稍作修改。

GC-MS条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（He＞99.999%），流速1 mL/min。固相微萃取手动进样，不分流进样，进样口温度250 ℃，热解吸时间8 min。升温程序：40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min升温到85 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min升温到130 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升温到210 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温到250 ℃，保持2 min。电子电离源；离子能量70 eV；质量扫描范围40～450 u。

1.3.1.4 挥发性成分的定性、定量分析

GC-MS实验数据由NIST17数据库的相似度检索进行初步定性，同时结合参考文献中相应化合物的保留指数进一步定性。

将正构烷烃（C7～C40）标准品在相同GC-MS条件下直接液体上样分析，计算保留指数，通过与NIST17数据库参考文献中相应物质的保留指数对比，进一步对样品中的香气物质进行定性。保留指数按式（1）计算：

式中：tx、tn、t（n+1）分别为待测物x、具有n、（n+1）个碳原子正构烷烃的保留时间/min。

利用内标法（2-壬酮）对香气物质进行定量，按式（2）计算：

式中：Cx和Mx分别为待测香气物质的质量浓度/（mg/L）和峰面积；Cy和My分别为内标物的质量浓度/（mg/L）和峰面积。

1.3.2 香气感官品评

1.3.2.1 感官评价人员的筛选

通过发放电子调查问卷的形式对报名人员的基本信息、健康状况等方面进行调查，进行初步筛选。经过GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分：优选评价员》中味觉测验、GB/T 12312—2012《感官分析 味觉敏感度的测定方法》中味觉灵敏度测验、GB/T 15549—1995《感官分析 方法学 检测和识别气味方面评价员的入门和培训》中香气识别能力测验后，进一步筛选出樱桃感官评价小组成员27 人，后备5 人，年龄跨度19～35 岁，男女比例1∶2。

1.3.2.2 樱桃品评

本项目的品尝工作均在符合以下规定的品评室内进行：光照适宜、亮度一致，便于清扫且无噪音，无任何气味，便于通气或排气，温度恒定（23～25 ℃）。收到新鲜樱桃样品后24 h之内开展香气感官品评实验，以部分樱桃样品为试品让品评员建立樱桃香气描述词。为避免已知品种名称对品评效果的影响，将9 种樱桃样品分为3 组，分别以三位密码编号按顺序呈送，评价员按顺序闻香、品尝，每次品尝后，用清水漱口。品评员根据樱桃香气描述词对9 个品种樱桃所感知到的香气进行选择，统计每种樱桃中香气描述词出现的频率，绘制风味雷达图。

1.3.3 基于Pearson相关系数建立樱桃香气感官品评与GC-MS结果间的关联网络

Pearson相关系数法常用于分析2 个变量X和Y之间的关系密切程度，可以评估2 个连续变量之间的线性关系。对于变量X=[x1，x2，…，xn]T和Y=[y1，y2，…，yn]T，其相关系数r的取值为[-1，1]，接近0代表无相关性，接近1或-1代表强相关性。按式（3）[26]计算：

理论上，Pearson与Spearman相关系数分别仅用于评估线性关系与单调关系。因此，后者对于数据错误和极端值的反映没有前者敏感。为了使两套数据更符合线性回归的规律，剔除可能会影响分析结果的错误数据和极端值，本研究选择Pearson相关系数对樱桃香气感官品评结果与GC-MS分析得到的香气物质含量数据之间进行Pearson分析，以建立二者之间的关联网络。

1.4 数据统计

采用SPSS 24.0进行数据的统计学分析；相关性分析，热图由R（Rx64 3.6.3）软件分析绘制；关联网络由Gephi软件分析绘制；偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析由The Unscrambler X 10.4软件分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析结果

通过GC-MS对9 个不同品种樱桃中香气物质进行定性、定量分析，共鉴定出63 种香气成分，大多数化合物在文献中均有报道[17-18]。其中酯类17 种，醇类10 种，醛类15 种，萜烯类10 种，酮类7 种，酸类种类较少，仅有1 种。此外，还有3 种其他化合物被检出。不同品种樱桃中香气物质总离子流图见图1，香气物质的平均质量浓度见表2。

表2 樱桃果实香气物质质量浓度Table 2 Concentrations of aroma compounds in cherry fruit

续表2

图1 各樱桃品种香气总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of aroma substances in different cherry varieties

醛类物质是樱桃香气中最主要的组分，这在前期研究中已经得到了证实[17,24]。除美早樱桃外，醛类化合物在所有樱桃样品香气中的比例均高于70%，以意大利红樱桃中醛类香气物质含量最高，达到42 635.3 μg/L。C6醛类和芳香醛类，如己醛、(E)-2-己烯醛、苯甲醛是樱桃的主要香气物质，这与相关报道一致[19,24]。己醛在萨米脱樱桃中质量浓度最高，为15 550.73 μg/L，占醛类物质整体的53.14%，具有较强的青香和蔬菜味。红灯、黑珍珠和雷尼樱桃中(E)-2-己烯醛占比较高，占醛类物质整体的50%以上，赋予樱桃苹果和生青味。意大利红和水晶樱桃含有较高的苯甲醛，它们来源于核果中苦杏仁苷的酶促水解或衍生自苯丙氨酸和苯甲醇等前体，具有强烈的烘烤味、扁桃仁味[19]。此外，壬醛、癸醛也是所有樱桃共有的醛类香气，赋予樱桃生青和柑橘味[17]。果实中醛类物质的形成和脂肪酸代谢途径有关，脂肪酸氧化途径可产生直链脂肪族醇、酯、醛和酮。在脂氧合酶的催化下，不饱和脂肪酸会生成C9、C10或C13氢过氧化物。这些物质可以在脂氢过氧化物裂解酶的作用下断裂，然后生成C6、C9或C10醛，而青草香和果香是以脂肪酸为前体的代谢产物的主要香气特征[27]。

除醛类香气外，萜烯类、醇类和酮类香气是樱桃果实中质量浓度较高的组分。主要的萜烯类香气包括里那醇、香叶醇、橙花醇、β-大马士酮，其中里那醇、香叶醇均具有较强的柑橘味。酮类香气物质主要包括香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮，二者在其他樱桃品种中也有过报道[19,24]。其中，6-甲基-5-庚烯-2-酮和β-大马士酮为樱桃中主要的降异戊二烯类香气，这些物质可能来自类胡萝卜素分子的直接降解，如β-胡萝卜素、叶黄素以及紫黄素等。降异戊二烯类香气物质的含量并不高，但因为它们的感官阈值比较低，特别是在酒中的作用不容忽视，可为葡萄酒带来丰富的花香、果香[28]。相比之下，酯类、酸类和其他类香气的质量浓度相对较低。除美早和佐藤堇樱桃外，其余7 种樱桃酯类、酸类以及其他类香气仅占香气总量的0.3%～2%。美早和佐藤堇含有相对较高的酯类香气，尤其是4-己烯-1-醇乙酸酯与苯甲酸乙酯，这也是二者特有的酯类香气。值得注意的是，美早樱桃中酯类香气在种类和质量浓度上均较高，因而可能含有更强的果香和酒香。

2.2 香气感官品评结果

如图2所示，有60%以上的品评员在9 个品种樱桃中均闻到了明显的青草味，苹果味也能被20%以上的品评员所感知。尽管青草和苹果香气是所有樱桃品种中共有的特征香气，但不同品种樱桃香气间仍存在较大差异。如红灯、意大利红和雷尼樱桃具有一定的甜橙味，红灯、美早樱桃分别具有独特的柠檬味和酒味，杏仁味在红灯和萨米脱樱桃中易被感知，意大利红、水晶和佐藤堇樱桃具有一定的李子味。此外，蓝莓味和玫瑰味在大多数品种樱桃中均能够被感知。

图2 樱桃香气风味剖面图Fig. 2 Cherry aroma profile

2.3 香气感官属性之间的Pearson相关性分析结果

从图3可看出，甜橙味与玫瑰味（r=0.84，P＜0.01）极显著正相关，与柠檬味（r=0.70，P＜0.05）显著正相关，说明样品的甜橙味对玫瑰味与柠檬味具有不同程度的影响；与上述相似的是，杏仁味与柠檬味（r=0.93，P＜0.01）、玫瑰味（r=0.72，P＜0.05）之间也存在同样关系。此外，柠檬味与玫瑰味（r=0.76，P＜0.05）达到显著正相关，表明樱桃的甜橙味、玫瑰味、柠檬味、杏仁味4 种香气感官属性之间相互关联，它们在樱桃香气感官属性中具有一定的连带性。此外，苹果味与蓝莓味（r=0.89，P＜0.01）间也达到了极显著正相关。

图3 香气感官属性之间相关系数散点图Fig. 3 Scatter diagram showing correlation coefficients between sensory aroma attributes

2.4 关联网络结果

对GC-MS分析结果中香气物质相对质量浓度数据和香气感官品评结果进行Pearson线性相关分析，绘制相关性热图并建立樱桃香气关联网络，结果分别见图4、5。

由图4、5可以发现，共有40 种香气物质与香气感官属性显著相关（P＜0.05）。香气感官品评结果表明青草味为樱桃主要的香气感官属性，而相关性分析结果中只有辛醛（新鲜青草味[32]）与青草味呈显著相关，分析原因可能是萃取头的选择性吸附问题。与PDMS萃取头相比，本研究选择的三相萃取头对非极性化合物（醛和酯）的萃取率低，这就导致一些青香香气（多为醛类化合物）不能被充分吸附，使仪器分析结果中醛类化合物与香气感官品评结果中的青草味未呈现很好的相关性[24]。

图4 香气感官属性与GC-MS分析结果之间的相关性热图Fig. 4 Correlation heat map between sensory aroma attributes and GC-MS analysis results

图5 关联网络图Fig. 5 Aroma network diagram

整体上看，果香与酯类、醛类香气物质正相关性较强，Voon等[33]在榴莲样品中同样发现果香与一些酯和醛类香气有很好的相关性。与甜橙、柠檬味显著相关的香气物质多为酯类和萜烯类化合物，多数酯类香气都具有果香和甜香[33]，萜烯类香气如里那醇、香叶醇也具有显著的柑橘味，表明香气感官结果得到的甜橙味和柠檬味可以很好被GC-MS分析结果解释；类似的，具有一定果香香气的苯甲酸甲酯、(E)-2-己烯醛、香叶基丙酮均与杏仁味呈极显著正相关。

与玫瑰味显著相关的香气物质有苯甲酸甲酯、苯甲酸2-乙基己酯和(E)-2-己烯醛，其中苯甲酸甲酯具有较强的花香[34]。

从图5可以明显看出，酒味与多种香气物质呈现相关关系，多为醛类和酯类香气。前期樱桃香气研究报道中均发现樱桃具有一定的酒香[11,15]，而本研究只有少数品评员感受到了樱桃的酒香。研究表明一般醇类化合物的感官阈值较高，这可能解释了本研究中的醇类化合物与感知到的酒味没有很好相关性的原因。而少数品评员闻到的酒味很可能是由于一些带有尖锐或辛香、刺激性气味的化合物存在，如4-乙烯基愈创木酚，或带有未成熟梅子香的甲酸己酯以及带有白兰地酒等酒香的化合物，如己酸乙酯、乙酸异戊酯、壬酸乙酯[11,15,35]，因为这些化合物与酒味高度相关。

从图5还可以发现，与甜橙味、柠檬味、杏仁味、玫瑰味相关的香气物质相似，与蓝莓味、苹果味相关的香气物质相似，这与2.3节中樱桃的蓝莓味与苹果味显著相关，甜橙味、柠檬味、杏仁味、玫瑰味4 种感官属性之间具有较强相关性的研究结果一致。

以上结果均表明樱桃香气感官属性可以很好地被GC-MS分析结果解释，通过Pearson线性相关分析建立樱桃香气感官属性与GC-MS间的关联网络具有一定可行性，证实了GC-MS在香气研究中具有一定替代感官品评的潜力。

2.5 PLSR分析结果

利用PLSR进一步验证由Pearson相关分析结果建立香气感官属性与GC-MS结果间关联网络的可靠性。以经过Pearson相关性分析筛选得到的40 种香气物质为X轴，9 种感官属性为Y轴进行分析，如图6所示，PLSR解释了71%的X方差和58%的Y方差。位于2 个椭圆之间的香气感官描述符和香气物质可以很好被PLSR模型解释，玫瑰味、甜橙味、杏仁味、柠檬味均与具有一定花香和果香的苯甲酸甲酯、香叶基丙酮、2-(苯甲亚基)辛醇等物质呈现出一定相关性，酒味与(E)-2-辛烯醛、4-乙烯基愈创木酚等多种香气物质呈正相关，表明这几种感官属性可以很好地被GC-MS分析结果解释。而青草味、李子味、蓝莓味、苹果味4 个感官属性位于内椭圆，说明这些属性间的相似度较大，对PLSR模型总方差贡献不显著，不能很好地被GC-MS结果解释[36]。综合关联网络结果，与青草味、李子味、蓝莓味、苹果味相关的香气物质较少，而其余香气感官属性均可以很好地被GC-MS结果中的香气物质解释，证实了利用Pearson相关性分析结果建立香气感官属性与GC-MS间关联网络的可行性。

图6 香气感官属性与GC-MS结果的PLSR分析Fig. 6 PLSR analysis of correlation between sensory aroma attributes and GC-MS results

3 结 论

本研究将樱桃香气成分的GC-MS仪器分析数据和香气感官品评结果相结合，采用Pearson相关性分析对二者的相关性进行分析，建立香气感官品评与GC-MS仪器分析间的关联网络。并利用PLSR分析验证关联网络的准确性。结果表明，香气感官品评中的甜橙味与里那醇、香叶醇等具有果香和甜橙香气的化合物达到显著或极显著相关；杏仁味、柠檬味同样与多种具有果香的香气物质显著相关；具有强烈花香的苯甲酸甲酯与玫瑰味显著相关，酒味与多种香气物质均达到了显著相关。因此，樱桃香气感官品评中获得的甜橙味、杏仁味、玫瑰味、柠檬味以及酒味等香气感官属性都可以被GC-MS分析结果中香气物质解释，且通过Pearson相关性分析结果建立香气感官属性与GC-MS间关联网络可以很好地展示二者之间的关系。

本实验利用樱桃香气研究证明，GC-MS对水果香气的仪器分析结果与感官品评结果在一定属性（剖面属性）上具有一致性，因此，采用Pearson相关性分析，建立香气感官属性与GC-MS结果间的关联网络，有望将客观、易于标准化的仪器分析与可视化、可传递感知信息的感官品评结合，使仪器分析在水果香气研究方面具有部分替代感官品评的潜力。