不同鲜味物质对干腌马鲛鱼鲜味的贡献与比较分析

黄煜燃，汪 薇，赵文红，杨 娟，刘巧瑜，白卫东

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225）

马鲛鱼（Scomberomorus niphonius），类属于鲈形目（Perciformes），鲭科（Scombridae），马鲛属（Scomberomorus），根据其种类可分为康氏马鲛鱼、蓝点马鲛鱼、中华马鲛鱼、朝鲜马鲛鱼和斑点马鲛鱼等。一般分布于北太平洋西部，同时也广泛存在于我国东海、黄海、渤海等海域，以黄海、渤海的产量最高，是我国重要的海洋经济鱼类之一[1]。马鲛鱼的营养价值极高，含有丰富的优质蛋白、必需氨基酸、多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等，因而备受消费者青睐[2-3]。

马鲛鱼的食用方式除了鲜食以外，还可以加工为腌制产品。腌制是水产品加工保藏最常用的方法之一，主要分为湿腌、干腌以及混合腌[4]。在国内，马鲛鱼一般采用干腌制法，但由于传统的高盐干腌制食品不利于人体健康，因此，近年来多采用低盐干腌制法。低盐干腌制法主要是用一定比例的钠盐（3%～6%）进行腌制，随后经过1～5 d的风干干燥工艺制作而成。此外，在干腌过程中也会添加其他辅料，如蔗糖和白酒等，以促进风味的产生。在腌制和风干成熟过程中，原料肉中水分流失、水分活度降低，微生物活动和组织内蛋白酶活性被抑制，从而可实现产品的长时间保存[5]。另外，蛋白质在微生物、组织蛋白酶、钙酶和肽酶等的作用下会降解为大量的小分子肽和游离氨基酸，使腌鱼制品具有特殊的咸鲜味[6-8]。

由于目前鲜见对干腌马鲛鱼滋味的研究，而对于其他干腌鱼如干腌鲐鱼[9]、带鱼[10]、草鱼[11]等滋味的研究结果显示其鲜味多被认为主要由鲜味氨基酸、核苷酸和鲜味有机酸赋予。因此，本实验以8 种不同加工工艺的干腌马鲛鱼为研究对象，采用高效液相色谱法对8 种干腌马鲛鱼常见的鲜味物质进行测定，并结合滋味强度值（taste activity value，TAV）和味精当量（equivalent umami concentration，EUC），分析并比较其鲜味物质的贡献和差异，以期为干腌马鲛鱼产品的改良和开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8 种干腌马鲛鱼购于不同产地厂家，分别编号为1～8号，其加工工艺条件如表1所示。样品经冷冻密封箱运回实验室后，去皮去骨，绞碎，分装，于-18 ℃冰箱贮藏待用。

表1 8 种干腌马鲛鱼加工工艺条件Table 1 Processing conditions for eight commercially available drycured Spanish mackerel

5’-腺苷酸（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP）、5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate，5’-IMP）、5’-鸟苷酸（guamosine 5’-monophosphate，5’-GMP）、肌苷（inosine，HxR）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）、乳酸、琥珀酸 美国Sigma公司；氨基酸混标及衍生试剂 美国安捷伦科技有限公司；细胞色素C（12 384 Da）、抑酞酶（6 511 Da）、杆菌肽（1 423 Da）、氧化型谷胱甘肽（621 Da）、Gly-Gly-Gly（189 Da） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均购于广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

HWS-12电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；自动化切向流过滤系统 瑞普利金（上海）生物科技有限公司公司；5810型高速冷冻离心机 艾本德中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌马鲛鱼的感官评定

感官评定小组由实验室的11 名专业评价成员（5 名男性和6 名女性）组成。评定前，对他们进行5 种基本味感（即酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味）和浓厚味的感官适应性培训。浓厚味是指食品中如浓厚感、丰富度、持续性、协调性和饱满圆润等一种综合性的味觉感受，参考Zhang Ninglong等[12]的方法，以谷胱甘肽的味感作为浓厚味培训标准。感官评定在温度为（25±2）℃的感官评定室进行，感官评分设定为1～10 分，其中1 分代表无味，5 分代表味感适中，10 分代表味感强烈。

1.3.2 乳酸和琥珀酸的测定

参照Chen Dewei等[13]的方法并略作修改，准确称取10.00 g碎肉，加入40 mL去离子水，于高速分散器10 000 r/min匀质1 min，重复3 次，8 200×g离心15 min，取上清液，过0.22 μm水系滤膜，待测。

色谱柱采用ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 2.8）；流动相A和B的比例为3∶97，等度洗脱，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃；检测波长214 nm。

1.3.3 核苷酸及其降解产物的测定

参照Ryder[14]的方法并略作修改。准确称取10.00 g碎鱼肉，加入已预冷的30 mL 5% HClO4溶液，用高速分散器匀质3 次（10 000 r/min，3×1 min），4 ℃、8 200×g离心15 min，取上清液，沉淀物再用10 mL相同浓度的HClO4重复以上步骤，合并2 次上清液，用5 mol/L KOH溶液调pH值至6.5，然后过0.22 μm水系滤膜，待测。

色谱柱采用ZIC®-HILIC（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为5 mmol/L磷酸二氢钾（pH 5.3），流动相B为乙腈溶液；洗脱程序为20%流动相A和80%流动相B等度洗脱，流速为1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，波长254 nm。

1.3.4 游离氨基酸的测定

准确称取5.00 g样品，添加15 mL 5 g/100 mL三氯乙酸，均质，定容到25 mL，超声30 min，放置1 h后，取滤液1 mL于1.5 mL离心管中，12 800×g离心10 min，用0.22 μm水系滤膜过滤。采用Agilent自动在线衍生的方法，用高效液相色谱仪分析。

1.3.5 肽分子质量分布的测定

参照莫加利等[15]的方法略作修改。准确称取10.00 g碎肉，加入去离子水，于高速分散器10 000 r/min匀质1 min，重复3 次，在鱼肉与水的比例1∶4（g/mL），温度40 ℃条件下水浴提取120 min，8 200×g离心15 min，取上清液，过0.22 μm水系滤膜，待测。

色谱柱采用TSKGel-G2000-SWXL（7.8 mm×300 mm）；流动相为乙腈-水-三氟乙酸（40∶60∶0.1，V/V），流速0.5 mL/min，进样量20 μL，柱温30 ℃，紫外检测波长214 nm。相对分子质量的对数值与洗脱时间拟合直线方程为y=-0.506 8x+15.757（R2=0.969 7），其中，y为标准肽分子质量的对数；x为保留时间。

1.3.6 呈味肽的提取与超滤分级

采用温水法[16]提取呈味肽，取粉碎均匀的鱼肉100.00 g，在鱼肉与水的比例1∶4（g/mL）、温度40 ℃、时间120 min条件下提取，2 000×g离心15 min，取上清液，即为其呈味肽提取液。

用自动化切向流过滤系统，用中空纤维过滤膜柱，将呈味肽提取液按分子质量的大小分级超滤浓缩，得到分子质量区间为5～10、3～5、1～3 kDa和小于1 kDa四个组分。

1.3.7 TAV及EUC的计算

TAV[17]按式（1）计算：

式中：C为滋味物质的含量/（mg/100 g）；T为滋味物质的味道阈值/（mg/100 g）。

若TAV＞1，则可以认为该物质对样品的滋味有重要贡献，若TAV＜1，则可以认为该物质对样品贡献不大。

EUC[18]按式（2）计算：

式中：EUC按每100 g样品含谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）质量计/（g/100 g）；1 218为协同作用系数；ai为鲜味氨基酸（Asp、Glu）的含量/（g/100 g）；bi为鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数（Asp为0.077，Glu为1）；aj为呈味核苷酸（5’-AMP、5’-IMP、5’-GMP）的含量/（g/100 g）；bj为呈味核苷酸相对于5’-IMP的相对鲜度系数（5’-AMP为0.8，5’-IMP为1，5’-GMP为2.3）。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析和相关性分析，采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 干腌马鲛鱼的基本味感分析

为了确认干腌马鲛鱼的基本味感特性，将8 种样品在不添加任何调味品的条件下进行蒸煮，并对5 种基本味感和浓厚味进行感官评价。如图1所示，咸、鲜味和浓厚味是8 种市售干腌马鲛鱼的主要滋味，而不同样品间咸味、甜味、苦味和酸味的滋味强度存在显著差异，且其差异性与工艺条件的差异密切相关。其中，风干时间为5 d的样品苦味高于风干时间1 d的样品；而风干时间1 d的样品咸、鲜味和浓厚味感则高于风干时间5 d的样品。这可能是风干时间较长，水分流失，盐含量逐渐增加，细胞结构被破坏，释放了体内的活性酶，使蛋白的水解程度更高，从而增加了产品的苦味肽含量[19]。此外，调味品的添加对其味道有显著影响，如在加工过程中添加蔗糖的4号样品甜味、鲜味和浓厚味感呈味得分均最高，而在加工过程中添加白酒的5号样品则呈现出轻微的酸味。

图1 8 种样品的感官评定雷达图Fig. 1 Sensory evaluation radar chart of eight samples

2.2 乳酸和琥珀酸对干腌马鲛鱼滋味的影响

乳酸和琥珀酸除了分别是酸味和鲜味的载体外，还能够协同其他物质起到增强呈味的作用，是水产品重要的滋味物质之一[20-21]。参考文献[22]中报道的呈味特征和阈值，对乳酸和琥珀酸的含量进行检测，结果如表2所示。干腌马鲛鱼样品中并未检出琥珀酸，而均检出乳酸，且乳酸呈味TAV均大于1，说明对干腌马鲛鱼的酸味和增味效果有直接贡献。此外，除5号样品外，6～8号样品的乳酸含量显著高于1～4号样品，说明长时间的风干工艺可能有助于乳酸的积累；4号样品中的乳酸含量显著低于其他样品，而5号样品中的乳酸含量则显著低于同类型样品，表示蔗糖和白酒的添加会抑制乳酸的产生。

表2 8 种样品的乳酸和琥珀酸含量Table 2 Lactic acid and succinic acid contents of eight samples

2.3 核苷酸及其降解产物对干腌马鲛鱼滋味的影响

鱼类死亡后，肌肉中的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在内源性酶和细菌肌苷核苷酶的共同作用下，会降解为相关的化合物（图2）。一般认为，5’-AMP和5’-IMP是鱼类重要的鲜味成分，能够显著提高食品的鲜味[23]。此外，IMP的降解产物也是鱼类风味的重要指标，当IMP降解为Hx时，会产生苦味，对鱼肉的品质有一定的影响[24]。

图2 鱼类死亡后体内ATP降解途径Fig. 2 Pathways of ATP degradation in fish after death

由表3可知，8 种干腌马鲛鱼样品均未检测到核苷酸，而不同程度上检测到了HxR和Hx，说明干腌马鲛鱼中的核苷酸已降解为HxR和Hx，且Hx含量显著高于HxR。这可能是因为ATP降解为IMP的过程十分迅速，一般在鱼体死亡后的数小时内达到最大值，随后便会在磷酸水解酶和核苷酶的作用下逐渐脱去磷酸和核糖而降解生成Hx[25]。此外，温度对IMP的降解也会产生一定的影响。Kuda等[26]研究发现，鱼类IMP含量随着温度的升高而逐渐下降。本研究中干腌马鲛鱼的干腌法工艺条件一般需要长时间腌制和风干，且已经过一段时间的贮藏，这些条件均会导致干腌鱼中的IMP降解为HxR和Hx。除此之外，5、7号和8号样品的Hx含量显著高于1～4号样品，说明长时间的风干可能有助于鱼肉中核苷酸的降解；这也是导致其苦味味感较为明显的原因之一，与图1结果吻合。

表3 8 种样品的核苷酸及其降解产物含量Table 3 Contents of nucleotides and their degradation products in eight samples mg/100 g

2.4 游离氨基酸对干腌马鲛鱼滋味的影响

游离氨基酸是水产品及其加工制品的主要呈味物质之一，其种类及含量会直接影响水产品的滋味特性，其中，谷氨酸和天冬氨酸被认为是水产品的主要鲜味物质之一。如表4所示，样品中谷氨酸的TAV大于1（除3、5、7号），而天冬氨酸的TAV均小于1，说明干腌马鲛鱼中的谷氨酸是影响其鲜味的主要氨基酸，但谷氨酸和天冬氨酸能与NaCl产生协同增效作用，从而提升鲜味味感[29]。同样地，其他氨基酸如精氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸在低于其阈值时也能增加呈味复杂性，并提高谷氨酸的鲜味强度[30-31]。此外，除添加了蔗糖的4号样品中总游离氨基酸和谷氨酸含量均高于其他样品外，风干时间对总游离氨基酸的影响不显著，表明蔗糖的添加对鲜味氨基酸的生成有促进作用。Zhang Jinjie等[11]通过对比草鱼干腌制过程中加入香辛料花椒和蔗糖对游离氨基酸的影响，同样发现了蔗糖的添加有利于鲜味氨基酸的生成。

2.5 干腌马鲛鱼的EUC及味感分析

由表4可知，8 种样品的EUC介于0.02～0.46 g/100 g之间。结合味精的阈值（0.03 g/100 g）计算可得，4号样品EUC的TAV远大于1，具有明显的鲜味特性，与图1结果一致；其余样品EUC的TAV均约等于1，说明鲜味味感较弱。此结果与感官评价结果不吻合，其可能的原因是干腌马鲛鱼样品中还存在其他鲜味物质，如鲜味肽等。目前研究认为，分子质量小于3 000 Da的寡肽具有一定的呈味效果，而小于1 000 Da的小分子肽具有显著的鲜味特性和增鲜效果[32-33]，是多数水产品的主要滋味贡献者，如肌肽、鹅肌肽和鲸肌肽等[34-36]。由于目前鲜见对干腌鱼制品中鲜味肽的研究，因此，为了进一步确定干腌马鲛鱼的主要鲜味贡献者，本实验对干腌鱼样品中的小分子肽组分进行感官评定和肽分子质量分布测定。

表4 8 种样品的游离氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents of eight samples

2.6 超滤组分鲜厚味评价与样品肽分子质量分布分析

通过超滤对干腌马鲛鱼的不同肽段进行截留，并进行感官评价，结果如表5所示，随着肽分子质量的减小，所有样品的鲜味和浓厚味逐渐突出，小于1 000 Da的肽段具有较高的鲜味和浓厚味得分，表明这部分肽段具有鲜味物质如鲜味氨基酸或鲜味肽等。而分子质量在1 000～3 000 Da部分肽段具有第2高的鲜味和浓厚味呈味得分，则暗示具有鲜味肽的存在。此外，可以看出5～8号样鲜味得分高于1～4号样，又结合肽分子质量分布的结果（图3）可知，5～8号中小于1 000 Da的肽段占比显著高于1～4号样，说明干腌马鲛鱼中的蛋白质在干腌过程中存在降解情况，且长时间的风干可能有助于小分子肽的积累，促使鲜味肽的产生[37]。

图3 8 种样品的肽分子质量分布Fig. 3 Peptide molecular mass distribution of eight samples

表5 超滤组分鲜味和浓厚味感官评分结果Table 5 Sensory scores for umami and kokumi taste of ultrafiltration components

3 结 论

不同加工工艺的干腌马鲛鱼鲜味物质的含量和组成存在一定差异性，这会对干腌马鲛鱼的滋味特性产生不同程度的影响。经过感官评价，8 种干腌马鲛鱼均呈现出明显的咸、鲜味和浓厚味感。通过对干腌马鲛鱼中游离氨基酸、有机酸和核苷酸的检测，以及呈味肽提取液的肽分子质量分布及超滤组分感官分析可知，赋予干腌马鲛鱼鲜味的主要物质是谷氨酸和小于1 000 Da的小分子鲜味肽。长时间的风干工艺，可能会增加产品的咸味和苦味味感，并能促使乳酸和Hx等产物的积累；腌制时添加的蔗糖和白酒等辅料能抑制乳酸的产生，且蔗糖能在一定程度上促进谷氨酸等鲜味氨基酸的形成。可见，加工工艺及辅料可能会影响干腌马鲛鱼滋味的形成。本研究探讨了赋予干腌马鲛鱼鲜味的主要贡献物质，为进一步研究干腌马鲛鱼的滋味调控提供了一定的理论支撑。