41份木槿种质资源的AFLP遗传多样性分析

窦 霄，陈俊强，董章凯，刘 红，段正洪

(1.山东省林木种苗和花卉站，山东济南250014；2.山东省林业科学研究院，山东济南250014；3.滕州市国有西岗苗圃，山东滕州277519)

木槿（Hibiscus syriacus）为锦葵科木槿属小乔木或灌木，是我国园林绿化和庭院绿化中常用的观赏植物，可做花篱式绿篱，孤植和丛植均可[1]。木槿开花量大，花色、花型多变，花期可由6月维持至10月，抗逆性较强，具备一定的吸附有害气体和滞尘功能[2]。木槿种质资源丰富，栽培历史悠久，分布范围广泛。但是目前我国对木槿的繁育栽培技术和园林应用研究较多[3-7]，对其遗传背景、亲缘关系尚未开展深入系统的研究。国内方面，肖芬等[8]通过对27 个木槿品种进行ISSR-PCR 分子鉴定，聚类分析结果与形态分类和孢粉学分析的结果具有较强的一致性。赵艺璇等[9-10]使用SRAP 法扩增了39 个木槿品种的DNA 条带，通过UPGMA 法进行聚类分析，得出了不同木槿变型及变种之间的遗传距离较远，不同木槿品种之间遗传距离相对较近，木槿亲缘关系远近与木槿表型性状之间存在一定联系。此外，还对22 个木槿品种进行了花粉形态和分类研究，通过扫描电镜进行形态特征及外壁纹饰观测，然后使用R 型聚类分析和主成分分析等方法，得出木槿种内蓝紫色单瓣品种之间亲缘关系相对较近，半重瓣品种之间亲缘关系相对较近，白色单瓣品种之间亲缘关系相对较近。国际方面，Sang Hoon Kim 等[11]用AFLP 分子标记及形态学评价对127 个木槿品种进行分类，并分析了品种间的亲缘关系。截至目前，只有少量木槿品种的遗传多样性和亲缘关系比较清晰，尚有大量木槿品种的遗传多样性和亲缘关系有待研究。本研究旨在对41 份木槿品种进行AFLP 分析，准确了解其遗传多样性及亲缘关系，为今后进一步挖掘优良木槿种质、培育新优品种和开展木槿育种研究提供有益参考和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与来源

供试材料于2020年8月取自浙江省嘉善县、江苏省沭阳县和山东省临邑县，共计种质41 份（见表1）。采集其健康、无病虫害的嫩叶，于低温下保存、运输，并立即提取其基因组DNA。

表1 供试材料Table 1 Materials used in the experiment

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 提取

采用Murray 和Thompson 的CTAB 法[12]从幼叶中提取DNA。提取后的DNA 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质量，剩余材料-80℃超低温保存。

1.2.2 AFLP 分析

利用北京鼎国生物技术公司生产的AFLP 试剂盒（EcoR I/Mse I 型）及其操作指南进行，分析41 份木槿种质间的亲缘关系。

1.2.2.1 限制性酶切及连接反应

限制性酶切及连接反应体系为20 μL，在0.5 mL离心管中依次加入对照模板DNA 4 μL （50 ng/μL），Adapter 1 μL，EcoR I/Mse I 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，ATP (10 mM) 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，ddH2O 7 μL。将混合液在离心管中混匀离心数秒，混匀离心数秒，37℃保温5 h，8℃保温4 h，4℃过夜。

1.2.2.2 预扩增反应

预扩增反应体系为25 μL，在0.2 mL 离心管中依次加入模板DNA 2 μL，Pre-ampmix 1 μL，dNTPs 1 μL，10×PCR buffer2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 18 μL。离心数秒，按照下列参数进行PCR扩增循环30 轮：94℃变性2 min；94 ℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸80 s；72℃延伸5 min。预扩增产物稀释20 倍，- 80℃保存备用。

1.2.2.3 选择性扩增反应

从64 对EcoRⅠ/MseⅠ引物对中筛选出带型清晰且多态性带较好的引物对9 对（表2）。扩增体系为25 μL，其中预扩增产物稀释后的DNA 样品2.0 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，EcoRI 引物和MseI 引物各1.0 μL （各8 种），dNTPs 0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。以上混匀，离心数秒，进行PCR 循环。第1 轮扩增参数：94℃30 s，65℃30 s，72℃80 s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。接着按下列参数扩增23 轮：94℃30 s，55℃30 s，72℃80 s，最后延伸5 min。

1.2.3 数据处理与分析

使用ABI377 自动测序仪对扩增产物进行电泳分离检测，DNA 测序仪将自动保存胶图。运用GENESCAN 3.1 分析软件打开胶图，对胶图进行数据提取。运用NTSYSpc2.1 软件，将原始数据转变为“0，1”矩阵（根据记录带的有无，有带的记为“1”，无带的记为“0”）。使用POPGEN 32 软件计算标记位点的多态性条带（PPB）、多态信息量（PIC）和有效等位基因数(Ne)。运用NTSYSpc2.1 软件，并根据相似性系数对41 份木槿种质采用非加权配对类平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 AFLP 扩增结果分析

从64 对AFLP 引物组合中筛选出9 对带型清晰稳定、呈多态性的引物，对41 份木槿种质的DNA进行选择性扩增（见表2），获得了较好的扩增效果。共扩增出733 条DNA 条带，多态性条带699 条，多态性位点平均95%，表明不同木槿种质之间存在一定的遗传差异。9 对引物中，扩增位点最多的是EACG/M-CAA 组合，为162 个；最少的是E-AGG/MCTT 组合，为114 个。扩增的多态性位点比率最高的是E-ACG/M-CAA，为100%；最低的是E-AGC/M-CAA 组合，为92%。

表2 木槿AFLP 分析结果Table 2 Results of AFLP analysis of Hibiscus syriacus

2.2 遗传多样性分析

Nei′s 基因多样性指数(H)和Shannon 信息指数(I)是度量遗传多样性水平的常用指标。41 份木槿种质的Nei′s 基因多样性指数为1.1801～1.2515，平均1.2076；Shannon 信息指数为0.1863～0.2445，平均0.2035，表明供试木槿种质有较高的遗传多样性。

2.3 遗传相似性分析

采用Nei- Li 相似系数(GS)对扩增结果进行计算，得到41 份木槿种质的遗传相似性矩阵。通过AFLP 检测结果分析，41 份木槿种质的遗传相似系数的变异范围为0.702～0.932。通过相似系数矩阵看出，在供试的木槿种质中，其中38（双丰4）和40（双丰6）的遗传相似系数最大，为0.932，且两者均位于山东省临邑县，其遗传距离最小，亲缘关系最近；20（红心）与34（小木槿）的遗传相似系数最小，为0.702，且两者分别位于浙江省嘉善县和江苏省沭阳县，其遗传距离最大，亲缘关系最远。

2.4 聚类分析

在遗传相似性系数基础上，通过UPGMA 法对41 份木槿种质进行聚类分析并绘制树状图（图1）。以相似系数0.87 为界，可将供试材料分为5 大类：第1 类仅含1 份种质，为1（柔粉红心重瓣），来源于浙江省嘉善县；第2 类有29 份种质，包括2（粉色雪纺）、3（木桥）、31（紫色绒球）、4（紫色法国酒馆）、9（牡丹）、24（千丝绊）、25（雪纺）、26（中国雪纺）、28（长苞重瓣紫粉）、5 （蓝莓冰沙）、15 （白花单瓣木槿）、7（雅致）、18（粉红巨人）、8（薰衣草雪纺）、10（紫柱）、11（花叶木槿）、14（薄荷）、21（紫玉）、6（玫瑰）、16（胭脂红）、17（单瓣紫通紫粉）、22（蓝色雪纺）、23（马丽娜）、13（阿芙罗狄）、20（红心）、27（白花重瓣木槿）、30（夏威夷）、12（树莓冰沙）、19（汉帛），其中25 份种质来源于浙江省嘉善县，4 份种质来源于江苏省沭阳县；第3 类仅含1 份种质，为29（红色法国酒馆），来源于浙江省嘉善县；第4 类有9份种质，包括32（紫裙）、36（双丰2）、38（双丰4）、40（双丰6）、39（双丰5）、37（双丰3）、41（双丰7）、35（双丰1）、33（星光雪纺），其中7 份种质来源于山东省临邑县，2 份种质来源于江苏省沭阳县；第5 类仅含1 份种质，为34（小木槿）。从聚类分析结果可以看出，41 份木槿种质资源的分类与其地理分布位置关系较大，同一来源地的木槿种质具有较高的遗传相似性，亲缘关系较近。

图1 41 份木槿样品的AFLP 分子聚类图Figure 1 The dendrogram of 41 Hibiscus syriacus samples by clustering analysis with AFLP fingerprint

3 结论与讨论

遗传多样性是生物生存、发展和进化的前提，是物种长期进化产生的结果[13]。本研究采用AFLP分子标记技术，获得了41 份供试木槿种质间的遗传变异情况及亲缘关系等信息。结果显示，41 份木槿种质间的遗传相似系数(GS) 为0.702～0.932，多态性位比率、Nei 基因多样性指数、Shannon 信息指数、遗传多样性的平均值分别为95%、1.2076、0.2035 和0.1282，表明41 份木槿种质资源具有较高的遗传多样性。同时，通过聚类分析得出，在遗传相似系数0.87 处可以将供试木槿种质划分为5 大类，且大部分来源于同一地区的木槿种质基本处于同一类，表明从浙江省嘉善县、江苏省沭阳县、山东省临邑县收集的木槿种质资源，在遗传多样性及亲缘关系方面与地理分布有着较为明显的关系。此外，34（小木槿）与其他木槿种质的亲缘关系均较远，是否与其他供试种质属于同一品种群还有待进一步试验证明。

木槿作为我国常用的园林绿化植物，具备花期长、花色艳、抗性强等特点，其资源的种类和数量繁多，分布范围广泛。本研究在分子水平上研究分析了木槿种质资源的遗传多样性，为木槿品种选育、良种保护等方面提供了参考依据。但是本研究所收集的41 份木槿种质资源仅涉及浙江、江苏、山东的3 个县，收集范围相对集中，因此研究结果在取材范围上有着一定的局限性。今后，还需进一步明确木槿种质资源的分布情况，扩大资源收集范围，并结合分子标记、形态学、孢粉学等鉴定方法，更加全面、准确地研究木槿种质资源的遗传多样性。