硫酸盐还原菌处理含高铼酸根离子废水研究

吉莉，李娜，王新明，钱天伟*，张桂香，胡变芳

（1. 太原科技大学 环境与安全学院，山西 太原 030024；2. 广东省环境资源利用与保护重点实验室，广东 广州 510640；3. 晋中学院 生物科学与技术学院，山西 晋中 030600）

0 引言

伴随着世界上化石能源的日益匮乏，核电事业将会得到更大的发展。核电站的运行每年都会产生大量的99Tc，其半衰期长达2.1×105年，远远超过了工程屏障的有效期，一旦工程屏障失效，将在水中以高锝酸根（TcO4-）的形态存在，溶解性强，难以被土壤颗粒吸附，极易在地下水中迁移。如何有效地阻滞VII 价的TcO4-，降低99Tc 在土壤和地下水中的迁移性，是处置库性能评价的重要依据。

锝是过渡金属中唯一所有同位素都是放射性的元素，其半衰期长、放射性强，对人类生存具有潜在威胁［1］。锝与铼是同族元素，具有相似的离子半径、核外电子排布、晶体结构、主要氧化态以及EhpH 图［2］，化学性质非常接近，且铼比锝的标准电极电势低，比锝更难被还原。已有学者以铼作为锝的替代元素进行了研究，丁庆伟等［3］使用实验室和计算机模型等多种不同方法进行了锝的动力学研究，Kim 等［4］利用铼作为锝的替代元素，研究了聚合物对锝的吸附效果，赵晶等［1］以铼作为锝的类似物研究了黄铁矿对锝的去除效果。因此，学者们经常用铼模拟锝的化学行为［5］，从而避免实验过程的污染。

硫酸盐还原菌（sulfate-reducing bacteria，简称SRB）是一类能进行硫酸盐异化还原反应的厌氧菌，其代谢产生的S2-可以与重金属离子反应生成难溶的硫化物沉淀，达到去除硫酸盐、沉淀重金属和提高pH 的效果［6］。Lovely 等［7］提出利用微生物以氢为电子供体将地下水中可溶性六价的铀转化为稳定的、溶解度很低的四价铀，进而防止其迁移扩散的设想。Lloyd 等利用静息态的固定化SRB 细胞在流式生物反应器中处理Tc（VII），结果表明，SRB 具 有 处 理 含 锝 废 水 的 应 用 潜 力［8⁃9］。研 究 发现，SRB 对于pH 和盐浓度具有一定的适应性，其可耐受不同的重金属和溶解的硫化物［10］。

有研究表明，pH、温度、重金属离子的初始浓度、菌接种量、碳源、反应时间均可影响SRB 对重金属的去除。徐建平等［11］通过响应曲面法确定pH、温度、重金属离子的初始浓度是影响SRB 去除重金属的主要因素，且最佳反应时间为5 d。宋霄敏等［12］通过研究SRB 对铅的去除，发现当菌接种量为10%（体积分数）和20%（体积分数）时，铅的去除率相差甚微，其最佳接种量应为10%（体积分数）。刘辰等［13］发现不同的碳源对SRB 的生长有影响，以乳酸钠作为碳源时，混合SRB 的生长最佳、乙醇其次、甲醇次之、葡萄糖最小。本实验在10%（体积分数）菌接种量以及5 d 反应时间的条件下，采用富集培养基对SRB 进行培养，研究了pH、培养温度及初始浓度对硫酸盐还原菌还原固定高铼酸根的影响，通过单因素和正交实验，获取最佳反应条件，为我国长寿命核素高锝酸根的安全处置提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

硫酸盐还原菌的驯化培养：实验所用厌氧污泥来源于山西省山阴县大营村地下水井挖掘过程中21 m 处的土柱，土柱置于30 ℃手套箱（Coy Labora⁃tory）中厌氧处理7 d。取土柱中心的土样置于无菌水中，采用稀释涂布法，对硫酸盐还原菌进行富集培养7 d。然后采用培养基进一步驯化培养，每7 d更换新鲜培养液，连续培养28 d 即获得实验用的混合SRB 菌液。

菌悬液的制备：将驯化后的混合SRB 菌液重新培养24 h，待菌液变为黑色且有臭鸡蛋气味后，将菌液以8 000 r/min 离心10 min，弃上清，收集菌体，采用无菌水配制成菌悬液（OD600=0.1）。

培养基配方及分量如下：K2HPO40.50 g/L，（NH4）2SO42.50 g/L，NaHCO30.50 g/L，CaCl20.2 g/L，MgSO41.0 g/L，乳酸钠20 mL/L，Vc 0.10 g/L，半胱氨酸盐酸盐0.50 g/L，酵母膏1.50 g/L，（NH4）2Fe（SO4）20.50 g/L。

1.2 实验方案

1.2.1 单因素实验

表1 单因素水平表Table 1 The levels of Single-factor experiment

1.2.2 正交实验

自单因素实验结果中各取3 个较优水平，利用La（34）正交表设计实验，在恒温生物摇床上振荡培养5 d 后进行ReO4-去除率的测定与分析，确定最佳还原条件。

1.3 标准曲线

取配置好的0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 μg/mL 的铼标准储备液各5 mL，用0.22 μm 微滤膜抽滤，取抽滤完成液加入0.5 mL pH=2.4 的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，0.5 mL 5%的（NH4）2SO4溶液，0.5 mL10%的酒石酸和1.5 mL 0.1%的乙基紫，加水至10.0 mL，振荡摇匀，再加入5.0 mL 苯，于摇床振荡10 min设置转速300 r/min。振荡完成后静置15 min，有机相分层；使用移液枪吸取有机相置于离心试管中，设置转速8 000 r/min，离心2 min，取上清液；将上清液置于石英比色皿中，在分光光度计（SP-756）上以浓度为0 的铼标准储备液的上清液作为空白对照，于波长610 nm［14］处测定吸光度，读数，绘制标准曲线（图1）。

图1 ReO4-的浓度-吸光度标准曲线Fig. 1 Linear relationship curve between ReO4-concentration and solution absorbance

1.4 检测方法

将处理后的样品离心，取上清液5 mL，并重复1.3 过程，将上清液置于石英比色皿中，在分光光度计（SP-756）上以纯培养基的上清液作为空白对照，于波长610 nm 处测定吸光度。

1.5 分析方法

式中：η是去除率，%；C0为的初始浓度，μg/mL；Ct为反应5 d 后的浓度，μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 单因素优化实验

由图2（a）可知，在培养温度为30 ℃、pH7.5 的条件下，当初始浓度为10 μg/mL 时，SRB 具有较高的降解能力，去除率达到61.23%。有研究表明，SRB 的还原效率随着重金属浓度降低而增加，的毒性作用主要表现在对化学需氧量（COD）、酶的代谢活性、细菌浓度或生物膜厚度等方面的影响［15］。当浓度增加到15 μg/mL～25 μg/mL 时，去除率开始呈下降趋势；且随着浓度的增加，下降趋势更为明显，即对菌体生长的抑制作用不断增加，这是因为过高的高铼酸根离子浓度引起SRB 酶的活性降低，还原效率降低，蛋白质变性，与必需阳离子竞争［16］导致细胞器的破裂和膜的完整性破坏，从而抑制SRB 的生长和代谢［17-19］。

图2 不同因素对SRB 去除ReO4-的影响（a）ReO4-初始浓度；（b）初始pH；（c）培养温度Fig. 2 Effects of different factors on ReO4-removal by SRB.(a)initial ReO4-concentration;(b)initial pH;(c)culture temperature

王辉等［20］对Cu2+、Zn2+、Cd2+和Pb2+等重金属离子的研究发现，高浓度的重金属均对SRB 产生抑制作用，且抑制作用随着浓度的增加而增强，抑制作用大小依次为：Cd2+＞Cu2+＞Zn2+＞Pb2+，且当Cu2+浓度大于10 mg/L 时，其对SRB 的毒性增强，影响的还原过程。姜勇等［21］对Fe2+的研究发现，当Fe2+浓度从100 mg/L 增加到150 mg/L～300 mg/L 时，培养7 d 对的最高去除率从93%降到63%。

由图2（b）可知，在培养温度为30 ℃、ReO4-初始浓度为10 μg/mL 的条件下，SRB 菌种的最适宜pH为7.5，去除率达57.94%。当pH 为4.5～7.5，去除率分别为22.49%、37.96%、46.47% 和57.94 %，而当pH 增加到8.5 时，去除率下降为35.21 %。已有研究表明，pH 是影响SRB 活力的主要因素［22］，不同的pH 条件下，SRB 菌群生长繁殖的速度会有差异［23］。当pH 为5～8，pH 值的升高可促进硫酸盐还原菌的大量生长［24］，其适宜生长的pH 值为7.0～7.5，在7.16 时生长最旺盛，代谢能力最强［25-26］。pH值可以引起细胞膜电位的变化，从而影响微生物对底物的吸收［27］。有研究表明，微酸性pH 值对硫酸盐还原有负影响，当pH 值低于5 时，SRB 就会失活［28］；在pH 高于9 的环境下，SRB 还原硫酸盐产生的H2S 对本身产生抑制作用，生长受限［29］，对金属的去除率下降。同时，由于SRB 在pH 为7.5 的环境下生长旺盛，导致大量H+被消耗，使得pH 值升高［30］，导致对的去除效率更低。

2.2 正交实验条件对ReO4-去除率的影响

实验选用3 个影响因素：高铼酸根浓度，pH，温度，每个因素分3 个水平［33］。 正交实验结果如表3所示。表3 中T表示实验总和指标，为某一因素某一水平的去除率之和，其中Ti1为每个因素的第一个水平的去除率之和。表示平均实验指标，为某一因素某一水平的平均去除率，其中为每个因素的第一个水平的平均去除率，且根据每个因素在不同水平下的指标，可选取其各自因素条件下的最大值为最优水平组合A1B3C3。表中R表示极差，是同一因素的中最大值减去最小值之差，因素的极差R越大，该因素对实验指标的影响也就越显著。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 实验方案的设计及其结果的直观分析Table 3 Design of the experimental scheme and the visual analysis of the results

已有研究表明，SRB 去除水中的ReO4-受多因素之间的相互影响。通过正交实验可知，高铼酸根的初始浓度是SRB 去除水中ReO4-的主要因素，这主要是因为放射性重金属对SRB 生物膜有一定的毒害作用，影响了硫酸盐还原菌的生物代谢［34］，且随着浓度的升高，SRB 的代谢活性受到抑制，ReO4-的去除率降低。当pH 接近中性时，SRB 的酶活性不断增强，ReO4-的去除率增强［35］，且大多数硫酸盐还原菌是中温菌，最适宜生长温度为30 ℃～35 ℃［20］。

本文研究结果显示，高铼酸根的初始浓度对SRB 还原的影响较大，其次是培养温度的影响，最后是溶液的初始pH。当初始浓度为5 μg/mL，pH为7.5，温度为35 ℃时，高铼酸根的去除效果最好，可达64.21%。

3 结论

（1）利用硫酸盐还原菌可以对高铼酸根具有一定的去除效率。实验结果表明，高铼酸根的初始浓度是影响去除效率的主要因素，其次是温度以及pH对其的影响。

（2）在单因素实验条件下，当高铼酸根初始浓度为10 μg/mL、pH 为7.5、温度为35 ℃时，硫酸盐还原菌对高铼酸根的去除效果最好，去除率可达63.01%。

（3）在正交实验条件下，当高铼酸根初始浓度为5 μg/mL、pH 为7.5、温度为35 ℃时，硫酸盐还原菌对高铼酸根的去除效果最好，去除率可达64.21%。

由于放射性物质实验的局限性，实验中以铼替代锝，此实验结果对于高锝酸根的处理及对土壤和地下水环境条件下的核废物处置具有一定的参考价值。