外周血CD4+CXCR5+Tfh水平对肺炎克雷伯菌感染者预后的影响

王雪峰，蒙 艳，秋 霞

肺炎克雷伯菌属于兼性厌氧的条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一，多发生于住院的体弱患者，尤其是ICU患者[1]。肺炎克雷伯菌可引起患者多部位发生感染，肺部最常见。因肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药，所以感染者预后较差，病死率高[1-2]，已成为影响患者生命安全的重要因素。因此，预防肺炎克雷伯菌感染、早期实施治疗、准确评估患者预后显得尤为重要。滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cell,Tfh）是一类位于淋巴滤泡的CD4+T细胞亚群，高表达趋化因子受体CXCR5，参与多种免疫与感染相关疾病发生过程[3-4]。既往研究显示，肺炎克雷伯菌等病原菌感染与体液免疫有关，而CD4+CXCR5+Tfh可参与免疫应答[5-6]。因此，推测CD4+CXCR5+Tfh可能在肺炎克雷伯菌入侵人体后的疾病进展中发挥重要作用。本研究拟通过检测147例患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平，分析其与肺炎克雷伯菌感染的相关性及对患者预后的影响，以期为肺炎克雷伯菌感染者预后改善提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年7月—2019年5月于西宁市第二人民医院ICU住院治疗的147例患者为研究对象。患者入院时急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ）均为5～12分（APACHEⅡ计算出急性生理学评分、年龄调整、慢性健康调整数据，将数据相加获得APACHE Ⅱ总评分，当评分在5～15分之间为重症，评分在16～35分之间为危重症，评分＞35分为极危重症）[7]。根据患者入院后是否出现肺炎克雷伯菌感染将其分为感染组（69例）和未感染组（78例）。根据感染组患者1年内生存情况，将其分为生存组（40例）和死亡组（29例）。

纳入标准：①肺炎克雷伯菌感染者均通过细菌培养确诊[8]；②病例资料齐全。排除标准：①近1周内使用抗炎药物、免疫抑制剂者；②伴有其他血液系统及自身免疫疾病者；③妊娠期或哺乳期妇女。本研究经我院临床研究伦理委员会批准，所有研究对象均为自愿参加。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集及保存 采集患者入院第2 d晨起空腹外周静脉血，密度梯度离心法获取单个核细胞，液氮冷冻保存待测。

1.2.2 CD4+CXCR5+Tfh水平测定 采用流式细胞术检测外周血CD4+CXCR5+Tfh水平。用淋巴细胞分离液将外周血单个核细胞分离后放入流式管，加入2 ml PBS缓冲液，1500 r/min离心5 min，弃上清，重复3次，控制细胞浓度在5×105个/ml左右，向流式管中加入5 μl CD4抗体（货号：251723，购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司）和1.5 μl CXCR5抗体（货号：H00000643-D01P，购自上海科敏生物科技有限公司）后混匀，室温孵育30 min，洗涤后重悬细胞，使用流式细胞仪（型号：BDFACSAria，购自美国BD公司）检测处理好的标本，每份标本至少获取10 000个细胞进行分析，记录CD4+CXCR5+Tfh占CD4+T细胞的百分比。

1.3 统计学处理 利用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析，计量资料符合正态分布，以±s表示，2组间比较行成组t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较行四格表χ2检验。采用多因素Logistic回归分析肺炎克雷伯菌感染者预后的影响因素。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比较 感染组外周血CD4+CXCR5+Tfh水平为（17.62±2.13）%，显著高于未感染组的（5.86±0.91）%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 感染组与未感染组外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比较（±s）Table 1 Comparison of CD4+CXCR5+Tfh levels in peripheral blood between infection group and non-infection group(±s)

表1 感染组与未感染组外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比较（±s）Table 1 Comparison of CD4+CXCR5+Tfh levels in peripheral blood between infection group and non-infection group(±s)

组别 例数 CD4+CXCR5+Tfh(%)未感染组 78 5.86±0.91感染组 69 17.62±2.13 t值 44.409 P值 0.000

2.2 肺炎克雷伯菌感染的单因素分析 感染组的住院时间、入住ICU时间、入住ICU时APACHE II评分、机械通气时间及心血管疾病、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）、接受手术、恶性肿瘤患者的比例均高于未感染组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；2组年龄、性别、入院病因及慢性肾功能衰竭患者比例比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

表2 肺炎克雷伯菌感染的单因素分析Table 2 Univariate analysis on Klebsiella pneumoniae infection

2.3 2组预后情况比较 分析感染组与未感染组患者1年内生存情况，结果显示，感染组1年病死率为42.03%（29/69），高于未感染组的19.23%（15/78），差异有统计学意义（χ2=9.073，P=0.003）。

2.4 肺炎克雷伯菌感染者预后的单因素分析 感染组中，死亡患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平、住院时间、入住ICU时间、入住ICU时APACHE II评分、机械通气时间及碳青霉烯类耐药、慢性肾功能衰竭、心血管疾病、MODS、接受手术、恶性肿瘤患者比例均高于生存患者，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；此外，死亡患者与生存患者年龄、性别、入院病因比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表3。

表3 肺炎克雷伯菌感染者预后的单因素分析Table 3 Univariate analysis on prognosis of patients with Klebsiella pneumoniae infection

2.5 肺炎克雷伯菌感染者预后的多因素Logistic回归分析 结合既往文献[9]进行变量筛选，将慢性肾功能衰竭、心血管疾病、住院时间排除在模型外。将肺炎克雷伯菌感染者是否死亡作为因变量，以CD4+CXCR5+Tfh、是否碳青霉烯类耐药、是否出现MODS、是否接受手术、是否有恶性肿瘤、入住ICU时间、入住ICU时APACHE II评分、机械通气时间作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示CD4+CXCR5+Tfh、碳青霉烯类耐药、入住ICU时APACHE II评分是影响肺炎克雷伯菌感染者死亡的独立危险因素（P均＜0.05），见表4。

表4 肺炎克雷伯菌感染者预后的多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on prognosis of patients with Klebsiella pneumoniae infection

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是一种肠杆菌科革兰阴性杆菌，可引起消化道、泌尿道、手术切口、皮肤软组织等多部位感染[10-11]。病原体一般可通过患者上呼吸道、雾化器、人工呼吸器及其他侵入式导管进入人体[12]。近年来，随着肺炎克雷伯菌耐药性增加，其临床治疗越来越困难，感染者病死率随之增加[13-14]。Tfh是B细胞中的一员，其功能异常与免疫系统及多种疾病的发生有关[15-16]。研究表明，Tfh是淋巴滤泡趋化因子CXCL13的受体，可被CXCL13趋化，进而募集到淋巴滤泡，最终对B淋巴细胞增殖与分化产生刺激，形成生发中心，此外Tfh还可促使免疫球蛋白发生类别转换[17-18]。因此，探究CD4+CXCR5+Tfh与肺炎克雷伯菌感染与预后的关系，对预防患者肺炎克雷伯菌感染、降低患者病死率具有重要意义。

本研究结果显示，肺炎克雷伯菌感染组外周血CD4+CXCR5+Tfh水平显著高于未感染组，与申卫红等[19]研究结果一致。上述研究结果提示，临床研究中外周血CD4+CXCR5+Tfh水平的异常升高对评估肺炎克雷伯菌感染有重要意义，早期评估感染发生风险可有效降低感染率。此外，本研究发现，肺炎克雷伯菌感染组中死亡患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平显著高于生存患者，进一步表明CD4+CXCR5+Tfh是肺炎克雷伯菌感染者死亡的独立危险影响因素，提示CD4+CXCR5+Tfh可能通过异常高表达在肺炎克雷伯菌感染过程中发挥重要作用，推测其可能机制为：肺炎克雷伯菌侵入人体后，成纤维细胞、巨噬细胞等炎症细胞释放增多，大量炎性因子产生，CXCL13水平升高，CXCL13趋化Tfh，进而募集到淋巴滤泡，进一步向生发中心和B淋巴细胞迁移，促进B淋巴细胞在生发中心增殖产生大量的免疫球蛋白，最终参与机体免疫应答反应。因此，CD4+CXCR5+Tfh水平增加不仅能提示患者发生感染，而且对评估患者感染程度有重要意义，有利于临床医师及时调整治疗方案。

本研究结果表明，肺炎克雷伯菌感染及其不良预后均与患者是否患心血管疾病、是否患MODS、是否接受手术、是否有恶性肿瘤、住院时间、入住ICU时间、入住ICU时APACHE II评分、机械通气时间有关，与唐丽玲等[20]研究结果部分一致。陈菲等[21]及田艳丽等[22]研究结果显示，肺炎克雷伯菌耐药性严重，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌引起的医院感染已引起重视。本研究多因素Logistic回归分析结果表明，碳青霉烯类耐药、入住ICU时APACHE II评分也是肺炎克雷伯菌感染者死亡的独立危险影响因素。上述结果提示，临床要对伴有基础疾病、接受过手术治疗、住院时间较长、入住ICU时APACHE II高评分等患者予以重视，密切关注其是否存在感染情况，同时要严格掌握碳青霉烯类等药物的使用指征，必要时可与抗生素联合使用，降低耐药率和病死率。本研究存在样本量偏小、因素分析不全面等不足，今后须进一步增大样本量、增加时间跨度、纳入更多影响因素进行深入分析。

综上所述，外周血CD4+CXCR5+Tfh水平在肺炎克雷伯菌感染者中显著升高，CD4+CXCR5+Tfh可能通过参与机体免疫应答影响感染者的预后。检测CD4+CXCR5+Tfh水平不仅对判断感染者的免疫状态有重要意义，也可为肺炎克雷伯菌感染者治疗提供依据。