新生鼠缺氧缺血性脑损伤远期行为学研究

林爱金，王洁琼，敖丽娟，陈茉弦

昆明医科大学康复学院，云南昆明市 650500；

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)由围产期缺血、缺氧引起，是导致新生儿脑损伤死亡或神经功能损害的最重要原因[1-2]，带来严重的神经系统后遗症，如脑瘫、癫痫、孤独症和智力障碍等[3]。动物行为学评价已作为较为可靠的手段应用于HIBD 模型，但主要集中于早期，且结论不一。本研究探讨脑损伤模型小鼠远期行为的变化，主要涉及运动、情绪和学习记忆。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠50 只，10 日龄，雌雄不限，体质量3.85～4.50 g，购自昆明医科大学实验动物中心，动物实验许可证号SCXK(滇)K2015-0002。室温(23±2)℃饲养，光照12 h(7:00 a.m.～7:00 p.m.)，自由饮食水。

1.2 试验器材

1.2.1 明暗穿梭箱

由塑料板围成40×40×35 cm 箱体，明箱底部和四壁均为白色，暗箱底部和四壁均为黑色，由一面40×35 cm的墙分隔，墙的底部中心有7×7 cm开口。

1.2.2 高架十字迷宫

由黑色木板围成两个开臂和两个闭臂，“十”字型摆放，臂底35×5 cm，闭臂墙高15 cm，开臂边缘由0.5×0.5 cm 的方块包围，距地面100 cm；中央平台为5×5cm正方形。

1.2.3 新事物试验箱

由透明塑料板围成50×50×50 cm 的正方形箱体，周围用黑布环绕。

1.2.4 Y迷宫实验

30×8×10 cm 迷宫臂3 个，相互间夹角120°。摄像机置于臂上方1.5 m，记录小鼠活动，Supermaze 分析软件(上海欣软信息科技有限公司)分析。

1.3 动物分组及造模

小鼠分为对照组(n=20)和HIBD 组(n=30)。HIBD 组异氟烷25 μl 吸入麻醉，固定于无菌动物手术台，颈部切口5～10 mm，分离左颈总动脉；5-0 丝线双重结扎左颈总动脉后离断，缝合伤口。手术操作控制在10 min内。

术后，小鼠置于带有母鼠气味的垫料上休息30 min，之后转移到母鼠旁休息1 h，再置于含8% O2和92%N2混合气体的34 ℃恒温缺氧箱中45 min。

对照组仅切开左颈部皮肤，暴露颈总动脉，不结扎，直接缝合伤口。

造模结束后放回母鼠身边自由饮食。

1.4 模型评价

于术后1 d 和3 d 行神经行为学评估，术后3 d 各组取3只小鼠行TTC染色，评估模型是否成功。

1.4.1 神经行为学评估

采用Longa 评分法：0 分，无神经功能损伤症状；1 分，不能完全伸展对侧前爪；2 分，先瘫痪侧转圈；3 分，对侧倾倒；4 分，行走困难、意识丧失。评分1～3分进入实验。

评定者对分组不知情，重复评估3次，取平均值。

1.4.2 TTC染色

每组取3 只小鼠，麻醉后断头取脑，肉眼观察脑组织大体形态变化。对照组左右大脑半球对称，体积未增大，未出现病理变化；模型组左脑组织轻微水肿，体积稍大于右侧，出现梗死灶，呈苍白色。见图1。

图1 两组大体观察

脑组织于-20 ℃冰箱中冰冻20 min 后，冠状切片，厚2 mm，置2%TTC 溶液中，37 ℃恒温30 min，4%多聚甲醛固定，拍照。结果与肉眼观察相似。见图2。

图2 两组TTC染色

造模过程中，结扎过程死亡2 只，缺氧过程死亡3 只；造模后，Longa 评分0 分2 只，未出现梗死灶4只。最终造模成功19只，进入后续实验。

1.5 行为学实验

小鼠于出生后2 个月行行为学实验，期间无小鼠死亡。实验开始前，小鼠适应环境3 d。

1.5.1 运动功能

采用悬吊试验。铁丝水平，距桌面50 cm，小鼠前爪抓握铁丝，记录小鼠悬吊时间。评分标准：1分，≤10 s；2 分，＞10～30 s；3 分，＞30～120 s；4 分，＞2～5 min；5分，＞5 min。

1.5.2 情绪

1.5.2.1 明暗箱试验

小鼠从明箱放入，自由活动5 min，记录潜伏期、明箱累积时间和进入明箱次数。

1.5.2.2 高架十字迷宫

将小鼠从中央区放入，头朝向开放臂，自由活动5 min，记录小鼠在中心区、开/闭臂停留时间以及进入开/闭臂的次数。

1.5.3 学习和记忆功能

1.5.3.1 物体识别试验

新事物试验箱左上角和右上角各放置一个形状大小相同的长方形物体；将小鼠从下墙中央放入，自由活动10 min；取出小鼠休息1 h；箱内一个长方体改为一个大小相似的圆柱体；小鼠同一位置放入，自由活动5 min。记录后5 min 内小鼠在新、旧物体旁停留时间，计算物体识别指数。

1.5.3.2 Y迷宫

先将一臂用挡板挡住(新异臂)，小鼠从其他任一臂进入(起始臂)，自由活动10 min。取出小鼠休息1 h。移除新异臂挡板，小鼠从起始臂进入，自由活动5 min，记录在三个臂的停留时间。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。所有数据符合正态分布，以()表示，组间比较采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 运动功能

HIBD 组悬吊试验评分(2.4±0.62)分，低于对照组的(3.0±0.58)分(t=2.785,P=0.01)。

2.2 情绪

2.2.1 明暗箱试验

HIBD 组潜伏期显著长于对照组(P＜0.001)，明箱累积时间和穿入明箱次数少于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 两组明暗箱试验结果比较

2.2.2 高架十字迷宫

HIBD 组开臂停留时间显著短于对照组(P＜0.001)，闭臂停留时间明显长于对照组(P＜0.01)。见表2。

表2 两组高架十字迷宫试验结果比较

2.3 学习和记忆功能

2.3.1 物体识别试验

HIBD 组旧事物停留时间长于对照组(P＜0.05)，物体识别指数低于对照组(P＜0.05)。见表3。

表3 两组别新物体识别试验结果比较

2.3.2 Y迷宫

HIBD 组起始臂停留时间短于对照组(P＜0.05)，新异臂停留时间短于对照组(P＜0.05)。见表4。

表4 各组别Y迷宫试验结果比较(s)

3 讨论

围产期缺氧、缺血导致新生儿死亡或残疾是一个重要的临床问题。每年早产并发症占全球新生儿死亡的29%，其中3%导致终生残疾[4]。新生儿HIBD 最常用的实验模型由Rice 等[5]于1981 年首次提出，即单侧颈动脉结扎后暴露于低氧环境中一段时间，根据缺氧暴露的持续时间，可诱导轻、中、重度损伤，模型利用出生7～12 d 幼鼠复制，约相当于人类妊娠36～40周。C57BL/6 小鼠对缺氧、缺血损伤特别敏感，适合研究新生儿脑损伤[6]。许多针对缺氧缺血性脑病的研究用出生10 d的小鼠[7-8]。

新生儿脑损伤与皮质下白质和灰质损伤、结构连接受损有关[9]，导致神经发育障碍[10]。由于海马、纹状体和皮质损伤，发育早期和晚期会出现焦虑相关行为和认知障碍，以及运动协调障碍[11]。脑缺氧、缺血会导致细胞代谢、发育和结构破坏，改变髓鞘形成模式，导致行为障碍[12]。

悬吊试验用于检测小鼠的运动能力[13]；明暗箱试验评价小鼠的自发活动和探索行为，反映是否存在焦虑、抑郁行为[14]；高架十字迷宫试验也用于评价小鼠的焦虑和抑郁行为[15]；物体识别试验[16]和Y 迷宫试验[17]主要用于评估小鼠的学习和记忆能力。

本研究显示，新生小鼠发生HIBD 后，运动、情绪和认知功能损害会持续到成年。早期诊断和治疗至关重要。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。