B细胞淋巴瘤-2基因多态性与结直肠癌的关系研究

付前聪， 赵勇， 刘兵

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率呈逐年升高趋势，严重威胁着人们的生命健康[1]。多数结直肠患者早期无明显临床症状，发现时已为中晚期，且部分患者发生淋巴结转移，增加了临床治疗的难度，严重影响患者的预后[2-3]。因此，寻找一种特异的生物标志物对于及时发现结直肠癌及控制病情发展具有重要作用。结直肠癌的发生与原癌基因激活、抑癌基因失活及基因误配等综合作用有关[4]。B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)为细胞凋亡抑制基因，Bcl-2异常表达在肿瘤发生、发展中具有重要作用[5]。然而，Bcl-2基因多态性与结直肠癌的关系目前尚不清楚。本研究选取90例结直肠癌患者，分析其Bcl-2基因多态性特征，并探讨Bcl-2基因型在结直肠癌发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年12月至2018年12月安徽省六安市人民医院收治的90例结直肠癌患者为研究组。纳入标准：符合“结直肠癌规范化诊疗”中结直肠癌诊断标准[6]；均经病理学证实；确诊前均未行放化疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍；合并急慢性肠炎、炎症性肠病等消化系统疾病；有精神疾病；妊娠或哺乳期妇女。另选取近3个月未发生疾病的同期健康志愿者90例为对照组。研究组中男47例，女43例；年龄26～74(48.32±6.91)岁；低分化29例，中高分化61例；淋巴结转移37例，无转移53例。对照组中男49例，女41例；年龄25～76(47.94±6.83)岁。两组性别(χ2=0.089)、年龄(t=0.371)比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法 采集所有研究对象外周静脉血3 ml(研究组于入院当日采血，对照组于体检当日采血)。采用医用离心机(日本日立公司)以3500 r/min离心10 min，提取血清，置于-80 ℃保存。提取所有血样DNA(按DNA试剂盒说明书进行，试剂盒购自上海信誉生物科技有限公司)，置于-20 ℃冰箱保存。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术检测Bcl-2基因-938C/A位点多态性，正向引物：5′-ATCAAGCCTGGCAACTCGAGCG-3′，反向引物：5′-CTGTGACCTATGCCACGCTTAC-3′，引物由大连宝生物工程有限公司合成，扩增片段长度为331 bp，将试剂加入PCR管中，按照如下PCR反应条件进行扩增：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续进行40次循环。采用限制性内切酶BccⅠ酶切扩增产物，酶切体系15 μl，缓冲液1.5 μl，二次蒸馏水3 μl，限制性内切酶0.5 μl，37 ℃过夜酶切，采用琼脂糖凝胶电泳检测Bcl-2基因-938C/A基因型。采用双盲法进行基因型判读(长度为304 bp的条带为C/C基因型，长度为304 bp、276 bp、225 bp的条带为A/C基因型，长度225 bp、118 bp的条带为A/A基因型)，由2位研究人员分别判读，对结果不一致的样本重新检测，基因分型成功率100%。

1.3 临床资料收集与随访 收集研究组患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、TNM分期等临床资料，通过档案查询或电话随访统计研究组患者的生存情况，随访时间为2015年12月至2020年12月，终点事件为结直肠癌患者全因死亡或随访截止。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验，Bcl-2基因-938C/A位点基因型频率实际值与理论值比较,差异无统计学意义(P>0.05)，可用于后续研究。

2.2 两组Bcl-2基因-938C/A位点基因多态性分布 研究组Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型频率低于对照组，A等位基因频率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组Bcl-2基因-938C/A位点基因多态性分布 [例(%)]

2.3 研究组中Bcl-2基因-938C/A位点基因型分布与临床病理特征的关系 低分化患者中Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型频率低于中、高分化患者，淋巴结转移者中Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型频率低于无淋巴结转移者，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 研究组中Bcl-2基因-938C/A位点基因型分布与临床病理特征的关系

2.4 Bcl-2基因-938C/A位点基因型与患者生存的关系 研究组患者随访2年，其中4例失访，失访率为4.44%(4/90)，28例死亡，2年死亡率为32.56%(28/86)，其中C/C基因型的2年死亡率为43.75%(14/32)，A/C基因型为33.33%(13/39)，A/A基因型6.67%(1/15)。行Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，Bcl-2基因-938C/A位点不同基因型患者的总生存期差异有统计学意义(χ2=6.063，P=0.048)，A/A基因型的生存情况较好，见图1。

图1 Bcl-2基因-938C/A位点不同基因型患者的生存曲线

3 讨论

结直肠癌是一种发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤疾病，与环境、饮食、遗传等因素有关[7]。然而，结直肠癌的早期症状不明显，容易被忽视[8]。结直肠癌的发生发展由多种基因参与调控，其发生机制与细胞的失控性增殖及细胞凋亡的平衡关系密切[9]。此外，肿瘤细胞的侵袭及转移与癌基因调控失调有关[10]。当前，从基因层面寻找结直肠癌早期诊断及临床治疗的靶点成为目前临床关注的焦点。

Bcl-2位于人类18号染色体长臂2区1带，其翻译产物通过抑制细胞凋亡从而延长细胞存活期，在多种癌症细胞中异常表达[11]。本研究结果显示，研究组Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型频率及A等位基因频率均低于对照组，提示结直肠癌患者A/A基因型频率及A等位基因频率较低。郑艳清等[12]研究表明，结直肠癌患者Bcl-2蛋白阳性表达率低于健康对照，与本研究结果相符。此外，本研究发现，低分化患者Bcl-基因-938C/A位点A/A基因型频率低于中、高分化患者，淋巴结转移者中Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型频率低于无淋巴结转移者，说明结直肠癌患者淋巴结转移及分化程度均与Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型有关，A/A基因型结直肠癌患者淋巴结转移的可能性较低，提示A等位基因可能是结直肠癌的保护性基因。尹博等[13]研究报道，Bcl-2表达与食管癌分化程度及有无淋巴结转移有关。有研究报道，Bcl-2基因-938 A基因位点是位于Bcl-2抑制性启动区P2的一个多态性位点[14]。Bcl-2可通过稳定线粒体膜，阻断钙离子和细胞色素C释放，从而抑制细胞凋亡[15]。本研究行生存分析发现，Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型的总生存期明显高于C/C基因型和A/C基因型的总生存期，进一步说明了A等位基因对结直肠癌的保护作用。管泱等[16]研究发现，子宫内膜癌组织中Bcl-2表达与子宫内膜癌患者5年生存率有关，可作为预后评价的辅助指标。因此，结直肠癌的发生发展与Bcl-2表达有关，且结直肠癌患者A/A基因型在肿瘤分化、淋巴结转移及患者预后生存中发挥重要作用，可作为临床监测的辅助指标。

综上所述，Bcl-2基因多态性可能与结直肠癌发病相关，Bcl-2基因-938C/A位点A/A基因型患者低分化及淋巴结转移的风险较低，预后较好。然而，本研究病例样本有限，研究结果可能存在一定偏差，此外，肿瘤的发生发展及淋巴结转移与肿瘤性质、基因激活、调控及基因变异等多种因素有关，研究结果之间可能存在差异。因此，Bcl-2基因多态性与结直肠癌的关系及其相关分子机制仍需进一步深入研究。