经尿道膀胱癌等离子电切术联合吉西他滨膀胱灌注患者血清miR-30b、miR-92a水平及临床预后

穆元忠， 郭虎林， 杨世荣， 赵刚， 陶涛

膀胱癌是一类发病率较高的泌尿系统肿瘤，其主要类型是非肌层浸润性膀胱癌，该类膀胱癌的复发率高，是威胁患者安全与健康的极大隐患[1]。研究能预防及监测非肌层浸润性膀胱癌术后复发甚至病情发展的手段是当前的研究热点。膀胱癌的治疗方法主要是肿瘤病灶的局部切除结合化疗药物经膀胱灌注，其中经尿道膀胱癌等离子电切术联合吉西他滨治疗是使用较多的方法。与传统的单手术切除法或单纯放、化疗方法相比，放疗与化疗联合的治疗效果更优，但预后仍不尽如人意，尚有较大的改善空间，因此，探究影响肿瘤发病的相关基因，从生物遗传学角度认识膀胱肿瘤发生的相关机制，是临床诊断及治疗的根本方向[2-4]。微小RNA(miRNA)是具有调控作用的内源性小分子RNA，其一般表达于基因转录之后。研究表明miRNA可以在肿瘤细胞进行生物学活动的多个过程中起不同作用，具有保守性、时序性及生物学特异性等特征[5-7]。有学者提出miRNA是一种另类的基因调控方式，有些miRNA(如miRNA-23a、miRNA-218等)的表达与肿瘤术后的效果相关[8-9]。miR-30b及miR-92a是近年来发现的异常表达于肿瘤组织或细胞中的特殊miRNA，二者均能抑制癌细胞生长[10-11]，但目前关于miR-30b及miR-92a与膀胱癌关系的研究较少。本研究选取85例膀胱癌患者，采用经尿道膀胱癌等离子电切术联合吉西他滨治疗，通过检测其血清miR-30b、miR-92a水平，探讨其与患者临床预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2018年10月于青海省第五人民医院确诊并治疗的85例膀胱癌患者(膀胱癌组)。纳入标准：①经腹部B超、尿路造影及磁共振确诊非肌层浸润性膀胱癌；②经膀胱镜检查及活检，采用2016年WHO出版的泌尿系肿瘤病理分类及2017年美国癌症联合委员会(AJCC)制定的第8版TNM分期标准，确诊为Ta或T1期非肌层浸润性膀胱癌；③膀胱癌首次就诊者；④膀胱癌未转移；⑤患者一般资料完整；⑥受试者及家属均知情并签署受试同意书。排除标准：①受试前进行过手术或放化疗；②合并膀胱癌其他并发症或血液系统疾病或其他肿瘤者；③不配合预后检查者；④行二次及以上电切术者。选取同期进行健康体检者57人为对照组，两组研究对象的性别、年龄及体质量指数(BMI)差异无统计学意义(P>0.05，表1)。本研究经我院伦理委员会批准。

表1 膀胱癌组和对照组患者一般资料比较

1.2 主要药品及仪器 吉西他滨(批准文号：国药准字H20030105，规格：0.2 g，江苏豪森药业股份有限公司)；RGL-2000A型体腔热灌注治疗机(吉林迈达医疗器械股份有限公司)、总RNA提取试剂盒(上海一基实业有限公司)、分光光度仪(上海向帆仪器有限公司)。

1.3 膀胱癌治疗方法 行经尿道膀胱癌等离子电切术切除肿瘤组织直至深层肌，同时切除距离膀胱肿瘤组织2 cm周围的膀胱内黏膜组织。于电切术后1 d内用吉西他滨对患者膀胱进行灌注，首先每周灌注1次，持续6周；然后每两周灌注1次，持续12周；最后每月灌注1次，持续6个月；每次灌注后保留时长为1 h。具体方法：用50 ml生理盐水溶解1 000 mg吉西他滨，通过放置好的导尿管将吉西他滨稀释液灌注于患者的膀胱中。指导患者定时翻身(仰卧、俯卧、两边侧卧和坐位)，以使吉西他滨药液均匀地附着在患者的膀胱黏膜上皮上，1 h后导出灌洗液。

1.4 qPCR法检测两组受试者血清miR-30b、miR-92a水平 于入院第2天清晨抽取受试者肘静脉血5 ml，静置1.5 h左右，离心操作得到血清，用试剂盒提取总RNA，用分光光度计检测RNA的浓度、纯度。以U6为内参照，引物序列见表2。按如下qPCR操作流程：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸1 min，检测血清中miR-30b、miR-92a的相对表达水平。

表2 miR-30b、miR-92a的引物

1.5 预后评估及随访 通过电话询问方式对患者预后情况进行随访，共随访40个月，若有复发则停止随访。每3个月进行一次膀胱镜检查，取膀胱组织于显微镜下观察复发情况。每3个月进行一次B超及X线片检查，对疾病进展进行监测。记录患者血小板下降、膀胱刺激、脱发及呕吐症状等不良反应发生情况。

2 结果

2.1 膀胱癌组治疗前与对照组血清miR-30b、miR-92a水平比较 膀胱癌患者治疗前的血清miR-30b、miR-92a表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.001，表3)。

表3 膀胱癌组治疗前与对照组血清miR-30b、miR-92a水平比较

2.2 膀胱癌患者治疗前后血清miR-30b、miR-92a水平比较 膀胱癌患者治疗后血清miR-30b、miR-92a表达水平高于治疗前，差异有统计学意义(P<0.001，表4)。

表4 膀胱癌患者治疗前后血清miR-30b、miR-92a水平比较

2.3 miR-30b、miR-92a水平与患者预后的关系

以膀胱癌患者治疗后的血清miR-30b表达水平(8.97)为界，将85例膀胱癌患者分为miR-30b高表达组(miR-30b>8.97)45例，miR-30b低表达组(miR-30b≤8.97)40例；行Kaplan-Meier生存分析结果显示：miR-30b低表达组治疗后的中位无进展生存期(20.41个月)低于miR-30b高表达组(31.55个月)，差异有统计学意义(P=0.032，图1)。以膀胱癌患者治疗后的血清miR-92a表达水平(0.99)为界，将85例膀胱癌患者分为miR-92a高表达组(miR-92a>0.99)48例，miR-92a低表达组(miR-92a≤0.99)37例；行Kaplan-Meier生存分析结果显示：miR-92a低表达组治疗后的中位无进展生存期(24.88个月)低于miR-92a高表达组(32.65个月)，差异有统计学意义(P=0.015，图2)。

图1 miR-30b高表达组与低表达组的生存曲线

图2 miR-92a高表达组与低表达组的生存曲线

2.4 miR-30b、miR-92a高低表达组患者的不良反应发生情况比较 miR-30b高表达组与低表达组患者治疗后的不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05，表5)；miR-92a高表达组患者治疗后的不良反应发生率低于miR-92a低表达组，差异有统计学意义(P<0.05，表6)。

表5 miR-30b高表达组与低表达组不良反应发生率比较 [例(%)]

表6 miR-92a高表达组与低表达组不良反应发生率比较 [例(%)]

3 讨论

近年来，膀胱癌的发病率因吸烟和接触芳香胺致癌物质而显著增加。在我国，膀胱癌是男性泌尿生殖系统恶性肿瘤之首[12]。在世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第9位。据统计，尿路上皮组织癌变人数占膀胱癌总发病人数的九成左右，并且大部分患者初次就诊就检出浅表膀胱癌，该类癌症未触及膀胱深肌层，可分为未浸润乳头状癌及膀胱原位癌等，患者的临床症状可表现为消瘦、腹部不适、尿液中带血及困乏等，对健康及生活产生严重影响。膀胱癌的性质复杂，具有发展快、易复发等特点，当发生癌细胞转移时疾病危险系数加大，每年约有10万人以上因患膀胱癌而死亡[13]。膀胱癌治疗时间长，治疗费用高，严重危害患者的身心健康，并对家庭及社会造成很大压力，所以探寻合适的治疗方案是当前膀胱癌治疗的热点。

目前临床治疗浅表型膀胱癌的常用方法为电切联合膀胱灌注化疗法，浅表型膀胱癌的术后复发可能性大，复发可导致肿瘤向肌层浸润性膀胱癌转化，肿瘤发生进展的风险极高，使得膀胱癌特异性病死率升高。临床常采用经尿道膀胱癌等离子电切术治疗膀胱癌，该手术有创面小、手术难度不大且患者易接受等优点，但其主要缺点为无法完全清除膀胱癌组织，对于微小的肿瘤增生上皮组织无法切除，导致手术后的预后较差[4,14]。在电切术后使用吉西他滨灌注膀胱能起到较好的治疗效果，但仍需要寻找合适的标志物对其进行检测和评估，以此判断个体差异，并及时调整手术治疗方案。部分miRNA在癌组织与机体正常组织中的表达水平有明显差异，研究发现，很多miRNA位于脆弱基因位点之上，证明miRNA对癌症的发展进程作用明显[15-16]。

既往研究发现miR-30b及miR-92a在膀胱癌中表达异常[17-19]，本研究分析经尿道等离子电切术联合吉西他滨膀胱灌注治疗前后膀胱癌患者血清miR-30b、miR-92a变化水平，结果显示膀胱癌患者血清miR-30b、miR-92a表达水平较对照组均明显降低，提示miR-30b、miR-92a与膀胱癌的形成有关。膀胱癌患者治疗后血清miR-30b及miR-92a表达水平较治疗前显著上升，说明膀胱癌患者治疗后的血清miR-30b、miR-92a表达水平向健康水平变化，手术治疗使膀胱癌患者机体逐渐转归。以膀胱癌患者治疗后的血清miR-30b表达水平(8.97)及血清miR-92a表达水平(0.99)为界，将患者分为miR-30b高表达组及miR-30b低表达组，miR-92a高表达组及miR-92a低表达组，结果发现miR-30b低表达组、miR-92a低表达组治疗后的中位无进展生存期(20.41、24.88个月)均低于miR-30b、miR-92a高表达组(31.55、32.65个月)，提示miR-30b、miR-92a均可作为监测膀胱癌预后的血清学标志物，二者高表达对该肿瘤的预后有一定改善作用。miR-92a高表达组治疗后的不良反应发生率比miR-92a低表达组低，说明miR-92a还影响到膀胱癌患者的用药不良反应，但不良反应与机体的耐受情况也有关系，尚需进一步研究。

综上所述，膀胱癌患者经尿道膀胱癌等离子电切术联合吉西他滨膀胱灌注治疗前后的血清miR-30b、miR-92a水平变化明显，血清miR-30b、miR-92a低水平提示患者预后较差，提高二者水平对于改善患者预后意义重大。但本研究纳入患者的样本量有限，且均为中国人，关于miR-30b、miR-92a对膀胱癌预后的确切作用尚需进一步探讨。