采用二喹啉甲酸法定量检测残留医用多酶清洗剂

唐媛 李丹 钱红梅 陈燕燕，3 秦蕾 池在龙，3

复用眼科手术器械的清洗必须使用清洗剂，而正确使用清洗剂可提高眼科手术器械的清洗效果。医用多酶清洗剂对有机物具有高效的去除效果，现已成为复用眼科手术器械清洗的首选。本课题组前期对全国127家医院的调查发现，有超过60%的医院在清洗眼科手术器械时使用医用多酶清洗剂[1]。一旦有医用多酶清洗剂残留，即使非常微量也会带来严重的眼部术后并发症。Parikh等[2]发现残留的医用多酶清洗剂可能导致角膜水肿和眼内炎症。多名学者研究报道医用多酶清洗剂残留于眼科手术器械可能会导致眼前节毒性反应综合征（Toxic anterior segment syndrome，TASS）的发生[3-5]。因此，为确保眼科手术的安全，有必要对眼科临床常用的医用多酶清洗剂进行科学可靠的检测和定量分析。

但目前临床上还没有一种针对医用多酶清洗剂残留的科学的定量检测方法，查阅国内外相关文献及指南[6-10]，均未发现医用多酶清洗剂残留的定量检测方法。本研究采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法对医用多酶清洗剂残留进行定量检测，验证该方法的重复性、准确性、回收率，为多酶洗涤用品在眼科临床上更加安全规范的使用提供依据和保证。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

医用多酶清洗剂：主要有效成分包括脂肪酶、蛋白酶、糖酶、淀粉酶、高级蛋白水解酶、协同酶和生化酶等（Endozime KWZ035001 XBJ1，美国鲁沃夫公司）；BCA试剂盒（P0009，上海碧云天生物技术有限公司）；医疗器械干燥箱（LWYL-400D，重庆优玛医疗科技有限公司）；96孔板（广州洁特生物过滤股份有限公司）；酶标仪（Spectramax M5，上海美谷分子仪器公司）；生化培养箱（SPX-150B-Ⅱ，上海跃进医疗器械公司）。

1.2 方法

1.2.1 BCA工作液及标准液的配制 参照BCA试剂盒说明书，将A液和B液以50∶1 的比例充分混匀，配制得到BCA工作液。将25 mg/ml的蛋白标准（Bovine serum albumin，BSA）稀释至0.5 mg/ml，用灭菌水对其梯度稀释，配制成浓度梯度分别为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml的BCA系列标准液。每次实验现配现用，绘制标准回归曲线和计算回归方程。

1.2.2 医用多酶清洗剂样品的配制 将医用多酶清洗剂原液分别按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300的比例与纯水混合，配制成各浓度梯度的医用多酶清洗剂样品。

1.2.3 BCA法测定步骤 在96孔板中依次加入200 μl的BCA工作液，再依次加入BCA系列标准液和检测样品20 μl，充分混匀后，于37 ℃生化培养箱中孵育30 min后取出，用酶标仪测定标准液和样品在562 nm波长处的吸光度。以蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线和样品的吸光度计算出所测样品的蛋白浓度。

1.2.4 BCA测量的方法学考察 BCA标准曲线的重现性试验：于不同时刻配制BCA系列标准液，测定吸光度，绘制标准曲线并计算其回归方程及相关系数（R2）。

BCA法回收试验：取浓度为100、500 μg/ml的标准蛋白各20 μl与200 μl的BCA工作液混匀，于37 ℃生化培养箱中孵育30 min，重复8次，分别测定100、500 μg/ml蛋白水平的回收率。

BCA法定量医用多酶清洗剂中的酶蛋白浓度试验：取医用多酶清洗剂原液、1∶50 及1∶100 稀释的医用多酶清洗剂样品，各8份，根据标准曲线和样品的吸光度求取所测样品的蛋白浓度，计算相应的标准偏差系数（Relative standard deviation，RSD）。

BCA法定量不同稀释比例医用多酶清洗剂中的酶蛋白浓度变化试验：取适量医用多酶清洗剂原液，1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300稀释的医用多酶清洗剂样品，每个样品测量3次取均值，通过标准曲线求得各样品中的酶蛋白浓度，绘制不同稀释比例医用多酶清洗剂中的酶蛋白浓度变化柱状图。

1.3 统计学方法

实验研究。采用EpiData 3.1 建立数据库进行平行双录入，同时建立核查文件，进行计算机逻辑核查。采用SPSS 25.0 统计学软件进行统计分析。本研究计量指标数据资料采用均数（Mean）、标准差（Standard deviation，SD）、标准偏差（Relative standard deviation，RSD）进行统计描述。本研究规定RSD＜5%。BCA标准曲线的计算采用最小二乘法进行线性相关与回归分析，本研究规定每条标准曲线波长的R2＞0.95。

2 结果

2.1 BCA标准曲线的绘制

用酶标仪测定蛋白标准液在562 nm处的OD值，根据测定结果绘制标准曲线（见图1），显示OD 值与标准蛋白浓度呈正相关，回归方程为=0.0009X+0.0955，相关系数R2=0.9995。

2.2 BCA法的准确性实验

2.2.1 BCA标准曲线的重现性试验 于不同时刻配制BCA系列标准液，共制作5次标准曲线（见表1），相关系数R2均＞0.95，可见波长为562 nm时，在相应浓度范围内均有良好的线性关系且重复性好。

图1.二喹啉甲酸法标准曲线Figure 1.BCA Standard curve.

表1.二喹啉甲酸法标准曲线回归方程与R2值Table 1.Regression equation of the standard curve of BCA and R2 value

2.2.2 BCA法回收试验 浓度为100、500 μg/ml的标准蛋白通过BCA 法测定的回收率分别为104.6%～112.8%、96.7%～102.2%，平均回收率分别为109.2%、99.8%，RSD分别为2.518%、2.123%。2种标准蛋白浓度测定的回收率RSD均＜3%（见表2），表明BCA法在样品处理过程中损失少，重复性好，具有良好的准确性和可靠性，测定蛋白质浓度有较高的可信度。

2.3 BCA法定量分析医用多酶清洗剂中的酶蛋白浓度

测定吸光度，依据标准曲线计算医用多酶清洗剂样品中的酶蛋白浓度。未稀释原液，1∶50、1∶100比例稀释医用多酶清洗剂样品中平均酶蛋白浓度依次为611、39、25 μg/ml，标准差依次为20.591、1.872、0.927 μg/ml，RSD依次为3.372%、4.832%、3.730%，3 组样品中的酶蛋白浓度的RSD均＜5%，说明BCA法检测医用多酶清洗剂中的酶蛋白浓度具有较好的重复性和稳定性。见表3。

2.4 BCA法定量不同稀释比例医用多酶清洗剂中酶蛋白的浓度变化

将医用多酶清洗剂稀释成6 个不同浓度梯度，结果显示稀释比例在1∶50～1∶200范围内，酶蛋白浓度随着医用多酶清洗剂稀释比例的增大而呈线性下降（见图2），将622 μg/ml的医用多酶清洗剂原液稀释至1∶200及以上时，酶蛋白浓度接近稳定。

表2.100 μg/ml和500 μg/ml标准蛋白的回收率测定结果Table 2.Recoveries of 100 and 500 μg/ml standard protein

表3.医用多酶清洗剂中酶蛋白浓度的定量分析结果Table 3.Quantitative analysis of enzyme protein concentration in medical multi-enzyme detergent

图2.医用多酶清洗剂不同比例稀释后的酶蛋白浓度变化趋势图采用的标准曲线为 Y^=0.0008X+0.1011，R2=0.9995Figure 2.Trend of enzyme protein concentration after different ratio dilution of medical multi-enzyme detergent.Linear regression equation of BCA standard curve is =0.0008X+0.1011,R2=0.9995.

3 讨论

众所周知，残留的医用多酶清洗剂可致使眼内炎、TASS等严重的眼部疾病。如何对医用多酶清洗剂残留进行精确可靠的定量检测成为临床上面临的一大难题。目前，医用多酶清洗剂的检测方法有定量和定性检测，以定性检测为主，如电泳法[11]及化学一般显色法等。有学者采用扫描电镜法（Scanning electron microscopy，SEM）结合能量色散X射线光谱分析（Energy dispersive spectroscopy，EDS）[12，13]，该法虽可确定医用多酶清洗剂中蛋白的元素组成，但因设备昂贵，操作复杂，目前仍停留于实验研究阶段。也有学者提出总有机碳检测法（Total organic carbon，TOC）[14]及液相色谱-串联质谱法[15]，虽可定量估算医用多酶清洗剂中的蛋白含量，但因实验周期长且存在不确定性，因此不适合在临床开展。

BCA法通过测量吸光度来确定蛋白质的含量，已成为一种常用的定量检测蛋白质的方法[16]，而常见的医用多酶清洗剂中的酶本质就是蛋白质。本研究首次将BCA法应用于医用多酶清洗剂的定量检测中，基于大量的实验，证实采用BCA法来检测医用多酶清洗剂残留时具有良好的重复性、准确性及回收率（见图1 和表1 ─3）。图2 表明医用多酶清洗剂在临床使用过程中，最佳配比浓度为1∶200～1∶300，这与该清洗剂说明书要求的配比浓度（1∶270）相似。在此范围内，医用多酶清洗剂含有相似的酶蛋白浓度，对手术器械具有稳定的清洁功效。

综上所述，本研究证明BCA法不仅可以通过目测试剂颜色的变化来快速作出定性判断，还可以通过紫外分光光度计或酶标仪的检测来定量分析医用多酶清洗剂的浓度。且BCA法在临床应用过程中具有成本低廉、操作简单、方便快捷、适用性强等优点，为医用多酶清洗剂残留的定量检验技术标准的建立提供新的思路，填补了指南和规范的缺陷，可推荐应用于临床工作，实时监测清洗后临床眼科手术器械表面医用多酶清洗剂的残留情况，预防和控制医源性感染的发生。本研究也存在着一定的不足，多酶清洗剂成分复杂，可能存在一些影响BCA法定量测定的物质，如蛋白增敏剂[17]、还原性物质[18，19]。在本项研究中，这些干扰物质未被去除。我们将在后续实验中通过沉淀蛋白质[20]和调整样品pH值[21]等方法，有效消除多酶清洗剂中各干扰物质对BCA法测定结果的影响，从而更精准地测定多酶清洗剂中酶蛋白的浓度。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明唐媛：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。李丹、钱红梅、秦蕾：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修。陈燕燕、池在龙：参与选题、设计和修改论文的结果、结论