CHI3L1拮抗IL-1β诱导髓核细胞炎症反应的机制研究

王睿哲，施强慧，张子凡，钟华建，王云浩，沈晓龙，曹鹏，陈华江，徐辰，袁文*

(1.海军军医大学附属长征医院脊柱外科，上海 200003；2.海军军医大学，上海 200433)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是腰痛和颈肩痛的主要病因之一，在全球范围内对患者造成巨大的经济负担以及生活质量的严重下降。IDD的病因十分复杂，包括基因、年龄、职业等多因素，但其具体机制仍不十分明确。近年来发现，炎症和基质代谢紊乱在IDD中发挥了重要作用。经典促炎因子IL-1β或TNF-α常用于体外构建髓核细胞的退变模型[1]。近年来，有研究[2-3]发现在退变的椎间盘髓核(nucleus pulposus，NP)组织中发现了几丁质酶3样蛋白1 (chitinase 3-like protein 1， CHI3L1)的表达水平升高，推测其可能参与椎间盘退变进程，但具体作用机制尚未见明确报道。1990年40 kDa大小的CHI3L1首次被描述为由滑膜细胞分泌的高度保守的肝素结合糖蛋白。CHI3L1 基因由10 个外显子组成，位于染色体1q31-q32 上，产物CHI3L1/YKL-40 由383个氨基酸组成[4]。相关文献表明炎症相关基因CHI3L1参与多种组织炎症反应以及组织损伤后的重塑过程，但其具体的作用目前尚未明确[1-2]。而在椎间盘退变进展中，炎症的发生发展发挥着十分重要的作用。因此，本课题将重点围绕炎症相关因子CHI3L1在椎间盘髓核细胞退变中的作用进行功能研究，以明确CHI3L1对椎间盘退变疾病的影响。

1 材料和方法

1.1 髓核组织样本的收集

本组获得患者或亲属知情同意后在术中获得人体椎间组织。实验方法按照批准的指南进行，研究由海军军医大学伦理委员会授权(批准号：13071002114)。人类的髓核(NP)组织均来自在海军军医大学附属长征医院进行椎间盘切除术的患者。在术中收集腰椎间盘突出症患者手术中的椎间盘样本作为退变组(IDD组)，同时收集腰椎外伤患者手术中的椎间盘样本作为对照组(IVD组，根据Pfirrmann分级进行收集，0级为正常样本，3～5级为退变样本)用于后续免疫组化和细胞培养。

1.2 髓核细胞的分离培养

取得正常NP组织样品后，立即用PBS洗涤NP组织样品2次，然后切碎并在DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)中用2 U/mL蛋白酶在37 ℃下消化30 min。通过用0.25 mg/mL Ⅱ型胶原酶(美国Gibco公司，目录号17101-015)在37 ℃处理4 h，从NP组织释放NP细胞。将剩余的细胞悬浮液转移到40 μm细胞过滤器(美国BD Biosciences公司)中，并以800 g离心5 min。将NP细胞重悬于含有10%FBS(美国Gibco公司)，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素和1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12中。当使用细胞计数试剂盒-8(日本Dojindo公司)评估时，悬浮细胞的存活率超过90%。将细胞在37 ℃，5%CO2中培养，每3天更换培养基。第二次传代的细胞用于随后的实验程序。对于体外NP细胞退变，我们通过使用Recombinant Human IL-1β(美国PEPROTECH公司)(25 ng/ml)处理NP细胞48 h以建立体外椎间盘退变模型。通过CHI3L1过表达质粒(和元生物技术上海股份有限公司)或者YKL-40人重组蛋白(北京义翘神州科技有限公司)过表达CHI3L1水平。通过干扰RNA敲低CHI3L1水平。

1.3 RNA抽提与实时定量PCR检测

使用RNAiSO(日本TAKARA公司)按照产品说明书从干预的人NP样品中收集总RNA。 用分光光度计(DU-800; 美国Beckman Coulter公司)在260 nm处测量总RNA的浓度。 根据产品说明书，使用带有gDNA Eraser(日本TAKARA公司)的PrimeScriptTMRT试剂盒进行20 uL最终反应混合物的逆转录。 通过使用TBGreen®PrepixEx TaqTM(日本TAKARA公司)和Step One Plus实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)进行实时PCR。 GAPDH用于标准化其他mRNA的基因表达。 根据比较Ct方法计算每种转录物的相对量。每个实验独立重复至少3次，引物序列见表1。

表1 定量RT-PCR分析中所有引物的寡核苷酸序列

1.4 干扰RNA转染

干扰RNA(siRNA)购自上海吉玛基因。根据Lipofectamine RNAiMAX Reagent(美国Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)的使用说明进行实验，将9 uL Lipofectamine RNAiMAX试剂在150 uL DMEM中稀释，同时将3 uL(30 pmol)siRNA稀释于另一管150 uL DMEM中并在使用前混合并温育5 min。siRNA的序列见表2。

表2 本研究中使用的siRNA序列

1.5 免疫组织化学染色

进行免疫组织化学以定位人NP样品中的CHI3L1表达。一般免疫组织化学方案已在别处描述[6]。简言之，石蜡包埋组织切取5 μm厚切片，切片在二甲苯中脱蜡，在乙醇梯度中再水化。洗涤后，在室温下用0.3%H2O2浸泡玻片，阻断内源性过氧化物酶活性，使用胰蛋白酶在37℃下进行抗原修复30 min，并在室温下用1%牛血清白蛋白封闭切片15 min。接下来，将切片在4℃下与以下一抗孵育过夜：针对CHI3L1的兔多克隆抗体(1：100稀释)。接下来，将第二抗体过氧化物酶缀合的亲脂性山羊抗兔IgG(1：1 000稀释，中国Proteintech公司)应用于切片，并将它们用苏木精复染色。先前已经描述了图像分析程序[5]，简要地，使用ZEISS显微镜(ZEISS Axio Imager A2，德国Carl Zeiss microscopy GmbH公司)对样品成像。免疫染色的载玻片由2位对患者数据和结果不知情的病理学家独立鉴定。当评估结果不同时，复审后应达成共识。在每个样品中，计数200个细胞，并且免疫阳性细胞的数量表示为该样品的比例。

1.6 Transwell分析

NP细胞被植入涂有基质凝胶的上室(美国BD Biosciences公司)。8 h后，以25 ng/mL的浓度处理炎症细胞因子IL-1β。培养48 h后，用拭子轻轻擦洗含上室表面基质凝胶中的细胞。为了在上室中观察迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，用0.1%结晶紫染色10 min，用ddH2O洗涤，直到水澄清。自然风干后，在显微镜下观察样品。

1.7 统计学分析

应用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行分析。使用D检验检测数据的正态分布。人NP组织中免疫阳性NP细胞的数据未通过正态性检验; 因此，通过应用双侧曼-惠特尼U检验分析。 其余数据通过正态性检验，正态分布的计量资料用表示，并进行双侧t检验或方差分析(ANOVA)，然后进行图基检验，分别对两组或多组进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 退变的人椎间盘髓核组织中CHI3L1表达增加

免疫组化结果显示，IDD组中髓核细胞CHI3L1的表达强度较IVD组显著升高(12.50±4.86比1.01±0.21，P<0.05)，见图1。

注：A：IVD组核组织；B：IDD组髓核组织

2.2 CHI3L1能够保护NP细胞退变

明确siRNA的转染效率后(图2)，在由炎症因子IL-1β诱导的人椎间盘退变模型中，通过使用siRNA敲低或通过质粒转染过表达来调控CHI3L1的表达，对其总RNA进行抽提并通过Real-time PCR检测相关基因的表达量。结果显示，在干扰CHI3L1组(siCHI3L1)组中MMP1、MMP3、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5等炎症相关基因显著上调，在过表达CHI3L1组中显著下降，见表3。此外，ACAN和COL2是经典的髓核细胞外基质合成基因，CHSY可以通过调节下游硫酸软骨素发挥促进细胞外基质合成的作用，也是重要的细胞外基质合成相关基因[7]，在过表达CHI3L1组中ACAN、COL2和CHSY等髓核细胞外基质相关基因的表达显著增加，并且在siCHI3L1组中显著降低，见表4。

1.51.00.50.0相对mRNA表达量***siCHI3L1-mixsiCHI3L1-2siCHI3L1-1siNC

表3 退变模型中炎症相关基因相对mRNA表达水平变化

表4 退变模型中基质合成相关基因相对mRNA表达水平变化

2.3 CHI3L1重组蛋白能够显著抑制IL-1β诱导的髓核细胞退变

在IL-1β诱导构建的髓核细胞退变模型中，通过在培养基中添加不同浓度的YKL-40重组蛋白，48 h后对其总RNA进行抽提并通过Real-time PCR检测相关基因的表达量。结果显示，培养基中添加不同浓度的CHI3L1重组蛋白均显著降低MMP3和MMP13等炎症相关基因的表达并同时能够上调ACAN和COL2等基质合成相关基因的表达，但其在200 μg/mL后效果进入平台期，提示存在最大效应浓度，见表5。

2.4 CHI3L1重组蛋白能够显著抑制髓核细胞分泌基质降解因子的能力

通过将髓核细胞中植入含有基质胶的Transwell小室检测不同处理下的髓核细胞分泌炎症相关因子对基质降解的侵袭实验，反应髓核细胞在处理后分泌基质降解因子能力的变化。通过。结果显示，IL-1β能够显著的诱导髓核细胞产生炎症反应分泌基质降解因子，促进髓核细胞穿膜，而过表达CHI3L1后能够明显减弱IL-1β的作用，减少基质降解因子分泌延缓髓核细胞穿膜，而siCHI3L1则明显相反(图3、表6)。

表5 不同浓度CHI3L1重组蛋白处理后相关基因相对mRNA表达量变化

注：A：空白对照组，B：白介素处理组，C：白介素+重组CHI3L1处理组，D：白介素+干扰CHI3L1处理组

表6 Transwell穿膜细胞量化分析比较

3 讨 论

正如许多研究报道，IDD的病因复杂，包括机械负荷超载，细胞衰老，炎症增强，水结合细胞外基质退化[8-11]。其中，炎症因素在IDD的进展中起着至关重要的作用，许多促炎因子均可导致IDD，如IL-1β、TNF-α、基质金属蛋白酶(MMPs)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(ADAMTS)等，其中最经典的为IL-1β[9]。然而，这些促炎因子通常作用于全身的多个组织中，它们基本都缺乏组织特异性，因此基于促炎因子的治疗在应用于临床之前仍需要克服许多问题[10]。并且，细胞外基质(ECM)的代谢对IDD非常重要。在IDD期间，ECM的合成代谢和分解代谢是不平衡的[11]。此外，在IDD进展中抗炎因子鲜有报道。 SIRT1可通过TLR2/SIRT1/NF-κB途径抑制IL-1β的变性作用[12]，而TIMP3可抑制MMPs和ADAMTS的表达[13]。这两种炎症相关因子在退变期间显著下降，并且是抗IDD的潜在保护因素。然而，它们作为抗炎因子的作用不是组织特异性的。在这里，我们开始寻找一种特异性内源性分子，能够保护由炎症引起的IDD。一些研究表明CHI3L1在椎间盘退变中的表达显着增加[2-3]，然而，CHI3L1在IDD中的功能尚未阐明。本实验中，我们通过使用免疫组化，同样发现在IDD中炎症相关的自分泌因子CHI3L1的表达量明显升高。

多种细胞能分泌CHI3L1，如软骨细胞，平滑肌细胞和骨肉瘤细胞，可以通过碳水化合物结合结构域结合几丁质，肝素，透明质酸和胶原[4]，其功能通常与炎症反应和组织重塑有关[5]。 Libreros等[14]发现在乳腺癌患者中，CHI3L1可显著促进炎症的发生发展并促进肿瘤的生长。Yeo等[15]指出炎症以及一些免疫疾病可诱导CHI3L1表达升高，并且同时，CHI3L1能够促进癌症的增殖、炎症细胞因子的产生和小胶质细胞的活化。Conroy等[16]表明在儿童疟疾中CHI3L1是急性肾损伤的一种生物标记物，CHI3L1通过促进炎症导致疟疾的进展。然而，它在炎症中的作用仍然存在较大争议，有些学者通过研究认为CHI3L1在炎症中主要发挥着抑制炎症的作用。Görgens等[17]提出在人骨骼肌细胞中，由促炎细胞因子诱导的新型肌细胞因子CHI3L1可通过自分泌或者旁分泌机制以抑制TNFα介导的炎症反应和胰岛素抵抗。Jung等[18]表明CHI3L1通过PPARδ抑制炎症反应和内质网应激，从而改善动脉粥样硬化反应。因此，本研究从IDD中明显高表达的炎性相关基因CHI3L1入手，进一步深入探究CHI3L1在IDD发生发展过程中的功能及机制。

有一些学者研究发现，在星形细胞瘤[19]、炎症性肠病[20]、胆管癌[21]、胃癌[22]、缺血性损伤[23]、哮喘[24]及胶质母细胞瘤[25]等疾病中，CHI3L1都可以通过激活AKT(PKB)通路调控疾病的进展。Tsiperson等[26]发现Akt敲除小鼠脊髓中IL-17等炎性因子的水平明显高于WT型小鼠，提出AKT3具有抑制炎症反应的作用从而抑制自身免疫性脑脊髓炎。Valls等[27]提出在构建的小鼠肺炎球菌性脑膜炎中，AKT缺陷小鼠不仅炎症相关基因的表达明显增高，而且生存率更差，其实质损害和血管浸润的组织病理学评分也显著增加。这些学者研究的结论为我们的发现提供了论据支持。而在本实验中，我们发现在构建的髓核退变模型中过表达CHI3L1或者使用CHI3L1重组蛋白后，髓核的炎症相关基因水平明显降低，而基质合成相关基因水平明显升高，提示CHI3L1在椎间盘退变进程中发挥着抑制炎症，促进细胞外基质合成的作用。因此我们提出自分泌蛋白CHI3L1在椎间盘退变中可能起到保护椎间盘退行性变的作用，而这一效应可能是由于通过调控下游的AKT，这可能具有潜在的治疗价值，仍有待进一步研究。

尽管本研究表明在IDD中CHI3L1发挥了重要的抑炎保护椎间盘的作用，但也有一些局限性。关于CHI3L1如何发挥抑制炎症、促进细胞外基质合成的确切机制远未完全揭示，而且缺少体内实验进一步明确。我们希望能够进一步进行关于CHI3L1在椎间盘退变中的分子机制研究。