利湿通淋颗粒中小檗碱和益母草碱的质量控制

袁敏，梁瑞雪，刘青

(山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

利湿通淋颗粒的组方是在经典方五味消毒饮、滋肾通关丸及程氏萆薢消毒饮的基础上，结合多年的临床经验化裁而来的治疗湿热瘀阻型慢性前列腺炎的有效方剂，具有消炎抗菌、清热利湿、活血通络的作用，该制剂组方由黄柏、蒲公英、石韦、益母草、苦地丁、金钱草、王不留行、皂角刺、川牛膝、绵萆薢等10味中药组成，临床使用多年，治疗湿热瘀阻型慢性前列腺炎及前列腺痛引起的各种症状疗效显著[1]。

本制剂所用黄柏为芸香科植物黄皮树(PhellodendronchineseSchneid.)的干燥树皮，习称“川黄柏”，具有清热、消肿、止痛等作用[2]。现代药理研究表明，黄柏在抗菌消炎、降血糖、抗癌及治疗免疫系统疾病等方面具有独特的疗效[3-4]，其所含主要化学成分为生物碱类和黄酮类成分，其中小檗碱、药根碱等生物碱类成分含量最高[5]。益母草为唇形科植物益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)的干燥地上部分，具有活血调瘀、利尿消肿之功效[2]。益母草是一种常见的活血化瘀药,《本草纲目》中称之为“血家之圣药”，除了有活血调经的功效之外,还具有良好的活血化瘀、祛腐生新作用，具有重要的临床应用价值[6-7]。益母草全草含生物碱质量分数为0.11%～2.09% ,其中益母草碱质量分数为0.02%～0.12%[8]。

在利湿通淋颗粒的质量标准研究中，曾对蒲公英中所含有机酸类成分绿原酸和咖啡酸、金钱草中所含黄酮类成分槲皮素、苦地丁中所含紫堇灵、石韦中所含的绿原酸、王不留行中所含王不留行黄酮苷、川牛膝中所含杯苋甾酮均进行了HPLC含量测定[9-14]。试验结果表明，在缺蒲公英或金钱草或石韦的阳性样品中绿原酸、咖啡酸、槲皮素的专属性试验均有干扰，对苦地丁、王不留行和川牛膝的供试品溶液多次调整制备方法和HPLC色谱条件，也未能成功检测到各药材所含成分的色谱峰，本处方中的皂角刺和绵萆薢在2015年版《中国药典》中没有明确的含量测定方法。黄柏中所含有效成分小檗碱和益母草中所含有效成分益母草碱均为利湿通淋颗粒中的主要药效成分，且小檗碱和益母草碱性质稳定，易于检测。

中药复方制剂成分复杂，相同类成分干扰较多。对方中多味中药进行了含量测定预实验，结果表明，HPLC含量测定以黄柏中的小檗碱和益母草中的益母草碱作为检测指标时，无其他成分干扰，且测定方法稳定可行，重复性良好，因此选择制剂中小檗碱和益母草碱的含量作为利湿通淋颗粒的质量控制指标，并对其进行方法学考察，为该制剂的质量标准控制提供依据。

1 仪器、试药与试剂

1.1 仪器

Waters e2695-2998高效液相色谱仪(美国Waters公司)；BT125D十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；SB5200DTS超声波双频清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)。

1.2 试药与试剂

盐酸小檗碱(批号0713-9906，质量分数98.14%，供含量测定用)，盐酸益母草碱(批号111823-201704，纯度94.30%，供含量测定用)，均购自中国食品药品检定研究院。利湿通淋颗粒及缺黄柏、缺益母草阴性样品均是根据处方工艺自制。

磷酸(批号20181212，莱阳市康德化工有限公司)；十二烷基硫酸钠(批号20160801，天津市鼎盛鑫化工有限公司)；辛烷磺酸钠(批号Q/12KM4285-2018 ,天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)为色谱纯；水为超纯水；所用其他试剂均为分析纯。

2 含量测定

2.1 小檗碱含量测定

2.1.1 色谱条件

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加流动相超声、溶解，制成每1 mL含26.0 μg的盐酸小檗碱对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取供试品颗粒2.0 g，研细，取约0.2 g，精密称定，置于100 mL量瓶内，精密加入流动相80 mL,超声处理40 min，放冷，用流动相定容，摇匀，采用0.45 μm 的有机微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.1.4 缺黄柏阴性溶液的制备

按照利湿通淋颗粒的处方比例，称取除黄柏之外的其他中药饮片，按照已经确定好的该制剂提取工艺和成型工艺，制得不含黄柏的阴性样品。按2.1.3项下供试品溶液的制备方法，制得缺黄柏的阴性溶液。

2.1.5 专属性试验

对盐酸小檗碱对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏阴性溶液分别精确吸取各10 μL，注入高效液相色谱仪(HPLC)，测定。结果在与对照品色谱相应的位置处，供试品溶液出现相应的吸收峰，而缺黄柏阴性溶液未出现干扰峰。说明该测定方法无干扰、专属性好,结果见图1。

图1 盐酸小檗碱对照品、供试品、缺黄柏阴性溶液的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride, test sample, and phellodendron negative control solution

2.1.6 线性关系考察

取2.1.2项下质量浓度为26 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，进样2、5、10、15、20 μL，按2.1.1项下色谱条件，分别注入高效液相色谱仪进行测定。以盐酸小檗碱的进样量(μg)为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，进行线性回归，得方程为Y=4 501 958X-2351，相关系数r= 0.999 6。试验结果表明，盐酸小檗碱在进样量为0.052～0.520 μg质量范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验

对2.1.2项下盐酸小檗碱对照品溶液，每次精确吸取10 μL，按照2.1.1项下色谱条件连续进样6次，测得对照品的峰面积值相对标准偏差(RSD)为0.604%(n=6)，说明仪器的精密度良好。

2.1.8 稳定性试验

取2.1.3项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h精密进样10 μL，测定供试品溶液的峰面积值，经计算，RSD为1.25%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验

取实验室自制的利湿通淋颗粒(批号20190528)，按照2.1.3项下供试品溶液制备方法平行操作6份，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，经计算，高效液相测定的小檗碱含量平均值为6.00 mg/g，RSD为1.00%(n=6)，表明分析方法的重复性良好。

2.1.10 回收率试验

取自制利湿通淋颗粒(批号20190528)6份，每份取约0.1 g，精密称定，置于100 mL量瓶内，分别精密加入质量浓度为0.063 8 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液10 mL，按照2.1.3项下供试品溶液制备方法平行操作6份，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，计算加样回收率。小檗碱的加样回收率均值为99.43%，回收率在96.20%～102.10%，RSD为2.08%，表明本方法的回收率良好。结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=6)

2.2 益母草碱含量测定

2.2.1 色谱条件

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取盐酸益母草碱对照品适量，加70%的乙醇制成质量浓度为19.8 μg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取自制的利湿通淋颗粒20 g，研细，取约2.0 g，精确称定质量，置于锥形瓶内，加入精确量取的甲醇50 mL,称定总质量，超声提取(250 W，40 kHz)40 min，冷却至室温，补足质量，振摇均匀，采用0.45 μm的有机微孔滤膜过滤，收集续滤液即得。

2.2.4 缺益母草阴性溶液的制备

按照利湿通淋颗粒的处方比例，称取除益母草之外的其他中药饮片，按照已经确定好的该制剂的提取工艺和成型工艺，制得不含益母草的阴性样品。按2.2.3项供试品溶液的制备方法，制得缺益母草的阴性溶液。

2.2.5 专属性试验

对盐酸益母草碱对照品溶液、供试品溶液和缺益母草阴性溶液分别精确吸取各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果在与对照品色谱相应的位置处，供试品溶液出现相应的吸收峰，而缺益母草阴性溶液未出现干扰峰。说明该测定方法无干扰、专属性好，结果见图2。

图2 盐酸益母草碱对照品、供试品溶液、缺益母草阴性对照溶液的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of leonurine hydrochloride, test solution, and leonurine negative control solution

2.2.6 线性关系考察

取2.2.2项下浓度为19.8 μg/mL的盐酸益母草碱对照品溶液，分别进样2、5、10、15、20 μL，按2.2.1项下色谱条件，分别注入高效液相色谱仪进行测定。以盐酸益母草碱对照品的进样量(μg)为横坐标，以测得峰面积为纵坐标，进行线性回归，得方程为Y=1 816 187X-9622，相关系数r=0.999 1，结果表明盐酸益母草碱在进样量为0.039 6～0.396 0 μg的质量范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.2.7 精密度考察

对2.2.2项下盐酸益母草碱对照品溶液，每次精确吸取10 μL，按照2.2.1项色谱条件连续进样6次，测得对照品的峰面积值RSD为0.827%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.2.8 稳定性考察

取2.2.3项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h精密进样10 μL，测定供试品溶液的峰面积值，经计算，RSD为1.62%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验

取同一批自制利湿通淋颗粒(批号20190528)，按照2.2.3项下供试品溶液制备方法平行操作6份，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，经计算，高效液相测定的益母草碱含量的平均值为0.106 6 mg/g，RSD为1.712%(n=6)，表明该分析方法的重复性良好。

2.2.10 回收率试验

取自制利湿通淋颗粒(批号20190528)6份，每份取约1.0 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶内，分别精密加入质量浓度为0.051 3 mg/mL的盐酸益母草碱对照品溶液2 mL，按照2.2.3项下供试品溶液制备方法平行操作6份，分别吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，经计算，益母草碱的加样回收率均值为101.2%，回收率在99.90%～102.6%，RSD为1.13%，表明本方法的回收率良好。试验结果见表2。

表2 回收率试验结果(n=6)

2.3 3批样品含量测定

取3个不同批号的利湿通淋颗粒(批号20190528、20190529、20190530)，按照2.1.3项下供试品溶液制备方法，每批平行操作3份，制备3批供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入高效液相仪测定，试验结果见表3。试验结果表明，该含量测定方法稳定可行，重复性良好。

表3 3批样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 提取方法的选择

在小檗碱的含量测定中，制备供试品溶液时，考察了提取溶剂甲醇、乙醇和流动相，试验结果表明，流动相提取的供试品溶液进行HPLC含量测定时，杂质干扰最少，提取的小檗碱含量最高，因此，选择流动相作为提取溶剂。在益母草碱的含量测定中，制备供试品溶液时，考察了提取溶剂甲醇、乙醇和70%的乙醇，试验结果表明，甲醇提取的供试品溶液进行HPLC含量测定时，杂质干扰最少，提取的益母草碱含量最高。因此，选择甲醇作为提取溶剂。

3.2 流动相的选择

在小檗碱的含量测定中，根据参考文献[17-19]比较了多种流动相系统，包括乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈-0.1%的甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基硫酸钠0.1 g)，结果表明采用乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基硫酸钠0.1 g)作为流动相，图谱的基线平稳， 峰型好，各峰均没有拖尾。益母草碱的含量测定中[10,20]，比较了甲醇-0.1%的甲酸水溶液、乙腈-0.01%的磷酸水溶液、乙腈-0.4%辛烷磺酸钠的0.1%的磷酸水溶液流动相系统，结果表明采用乙腈-0.4%辛烷磺酸钠的0.1%磷酸溶液，图谱的基线平稳，前后分离度较好[21-22]。

本试验所建立的利湿通淋颗粒的 HPLC 法同时测定小檗碱和益母草碱的含量，测定方法专属性强，重复性好，可用于利湿通淋颗粒的质量控制与分析。