高效液相色谱法测定高油脂植物源性食品中纽甜含量

戴琨，公丕学，薛霞，赵慧男，刘艳明，祝建华

1.山东省食品药品检验研究院（济南 250101）；2.山东省食品药品安全检测工程技术研究中心（济南 250101）

纽甜（neotame）是一种功能性甜味剂，特性优良，结构式如图1所示，适合添加到多类食品中[1-5]。但人工合成甜味剂的安全性受到广泛质疑，各国采取严格限制使用的政策[6-9]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定多类食品中纽甜的最大使用量[10]，如加工坚果和籽类的最大使用量为0.032 g/kg。高油脂植物源性食品是一类油脂含量高的植物性食品，如炒货、薯片均属于此类食品。

图1 纽甜的化学结构

报道的纽甜检测方法主要有高效液相色谱法[11-15]、液相色谱-质谱法[16-19]等，使用液质法检测时，基质效应大，定量准确性不够，液相法能对目标物进行准确定量。食品种类复杂多样，对于基质复杂的样品，需采取加沉淀剂[20-21]、固相萃取[22-24]等有效的处理方法。高油脂植物源性样品基质复杂，处理过程选用固相萃取法以获得较好的净化效果，文献报道使用较多的固相萃取（SPE）柱有C18、HLB等[22-24]，然而，处理高油脂类食品时此类SPE净化效果不佳，因此选用一种合适的净化方式处理此类食品很有必要。

试验建立固相萃取净化-高效液相色谱法测定高油脂植物源性食品中的纽甜含量。考察不同提取条件、净化方式对该类食品中纽甜的提取和净化效果的影响，以获得操作简便、定量准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纽甜标准品（纯度≥99%，曼哈格公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；醋酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；冰乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三乙胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；五香花生、糖炒花生、黑糖瓜子、奶油瓜子、薯片（均购于当地超市）。

混合提取液：分别吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 L。

UltiMate 3000型高效液相色谱仪（配有DAD检测器，美国Thermo Fisher Scientific公司）；N-EVAP型控温氮吹仪（美国Organomation公司）；ME2002T型电子天平（德国Mettler Toledo公司）；3-18KS型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；MS-3基本型旋涡混合器（德国IKA公司）；SB-800DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；固相萃取柱、Waters Atlantis T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Waters公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 纽甜标准溶液的配制

准确称取10.0 mg标准物质，用混合提取液溶解并准确定容至10.00 mL，充分摇匀，配制成1.00 mg/mL的标准储备液，取适量标准储备溶液，用混合提取液稀释，制成质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/mL的标准曲线系列工作溶液，于4 ℃保存备用。

1.2.2 样品的前处理

1.2.2.1 样品提取

时政热点的选择应该是正面向上的，要有积极的教育意义。青年学生长期在学校生活，对社会了解得不够深入，有时面对未来的生活茫然不知所措，思想上往往有片面性和理想化的特点，有时还带有主观主义和个人主义倾向，价值观的形成还不稳定，极易受到外界影响。因此，正面的时政热点案例的使用尤为重要，这就要求教师要多给学生讲授积极向上的话题，通过大量正面素材的教育帮助学生树立正确的世界观、人生观、价值观和坚定的政治立场、政治观念，从而树立起正确的政治方向。

试验前处理优化过程中使用的样品为能够代表高油脂植物源性食品的五香花生，称取5 g（精确到0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入20 mL 30%甲醇水溶液，涡旋分散混匀，超声波清洗器中超声提取20 min后，用离心机以8000 r/min的转速冷冻离心5 min，将上清液转移至另一支50 mL离心管中，用磷酸调节至pH 2后转移至25 mL容量瓶中，定容待净化。

1.2.2.2 样品净化

取PRiME MCX固相萃取柱，准确移取10 mL待净化液过固相萃取柱，控制流速不超过1 mL/min，待液体流尽后用5 mL 100 mmol/L甲酸铵（含2%甲酸）溶液淋洗，用5 mL甲醇淋洗，将小柱抽干，用5 mL甲醇（含5%氨水）洗脱，收集的洗脱液经45 ℃氮吹至近干，用1 mL 50%甲醇水复溶，超声10 min后，过0.22 μm微孔有机滤膜，滤液待上机检测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱采用Atlantis T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流动相流速0.8 mL/min；检测波长210 nm；进样体积10 μL。流动相A采用0.1%磷酸水溶液，流动相B采用乙腈，采用梯度洗脱程序，梯度条件见表1。

表1 流动相梯度程序

1.2.4 方法的线性范围和检出限

将纽甜标准曲线工作溶液按浓度由低到高依次经高效液相色谱仪进行分析测定，以纽甜标准工作溶液质量浓度（μg/mL）为横坐标，以响应峰面积（mAU·min）为纵坐标，绘制纽甜标准工作曲线，根据信噪比计算方法的检出限和定量限。

选用具有代表性的高油脂植物源性食品进行回收率和精密度试验，实验室检测空白样品为糖炒花生、黑糖瓜子、炸薯片，进行添加回收率和精密度试验，以纽甜添加浓度0.2，2和10 mg/kg这3个水平，每个水平重复测定6次，分别计算回收率及相对标准偏差。

1.3 数据处理

通过仪器配套的Chromeleon 7软件进行数据采集及色谱结果分析，采用Origin 8.0分析软件进行数据处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶液的选择

试验考察不同提取溶液对五香花生中纽甜提取效率的影响，纽甜添加浓度2 mg/kg。在用提取液提取过程中，样品中油脂的大量存在会影响到样品的分散及目标物的提取效果。选用混合提取液、甲醇水溶液、乙腈水溶液分别对样品中纽甜进行提取，结果发现，用混合提取液提取时，提取液较浑浊，上层有较厚油脂层，难以除去，影响目标物的提取效率和回收率；加入乙腈水溶液进行提取时，样品呈现糊状，冷冻离心后不能分层；用甲醇水提取时，样品混合均匀，冷冻离心后能够分层，因此，选用甲醇水溶液作为样品提取剂。试验进一步考察5%，10%，20%，30%，40%和50%（V/V）甲醇水溶液的提取效果，结果如图2所示。随着甲醇比例提高，回收率升高，甲醇水溶液中甲醇体积分数大于30%时，回收率下降。由图1可见，纽甜的结构中含有酯基，根据相似相溶原理，提高甲醇比例有利于提高回收率，而甲醇体积分数提高，提取液中油脂等杂质含量也随之增加，干扰纽甜分离，影响定量。因此，选用30%甲醇水溶液作为提取溶剂。

图2 不同比例甲醇水提取液对纽甜回收率的影响

2.1.2 净化方式的选择

由于高油脂食品基质复杂，样品提取液中油脂较多干扰纽甜检测，需要进行有效的净化，并对目标物进行富集。固相萃取法快速、简便、高效，因此，选用固相萃取柱对样品提取液进行净化处理。试验比较HLB、C18、MCX、MAX、PRiME HLB、PRiME MCX这6种SPE柱的净化效果，6种SPE柱的净化方法见表2。

表2 6种SPE柱的净化方法

经SPE柱净化并浓缩后，上机检测，样品的加标回收率结果如图3所示。结果表明，使用HLB、MCX、PRiME MCX柱时纽甜回收率较高，而使用C18、MAX、PRiME HLB柱时效果较差。在使用C18柱进行净化时，同时比较甲醇水提取液和混合提取液的提取效率，回收率分别为40%和30%。由于样品中脂肪、蛋白等杂质含量较高，甲醇水溶液的提取效率稍高一些，但C18柱不能有效地去除提取液中杂质，净化效果较差，干扰较多且回收率较低。PRiME HLB柱是一种通用型的固相萃取柱，能去除磷脂、蛋白等杂质，但回收率较低，推测原因是对目标物有一定吸附。使用HLB柱时，回收率虽然较高，但上机检测时杂质干扰较多，影响目标物的准确定量，且对不同种类的其他样品使用时，净化效果存在差异，有的样品净化后检测，杂质峰的存在严重干扰目标物的定量，效果较差。使用MCX柱时，净化步骤较复杂，上样速率较低，且上机检测时目标物附近干扰较多。而PRiME MCX是一款混合模式（反相和阳离子交换）固相萃取柱，杂质去除效果较好，干扰少，回收率高，对各种样品效果均较好，且不需活化，因此，选用PRiME MCX柱净化该类样品，能够提高检测的灵敏度和准确性。

图3 纽甜通过不同SPE柱的回收率

2.1.3 上样液pH的选择

PRiME MCX是反相和离子交换混合模式固相萃取柱，纽甜的结构中含有亚氨基和羧基，属于两性化合物，上样液的pH会影响纽甜的存在形式，从而影响与SPE柱固定相的结合效率。因此，试验考察上样液pH对纽甜回收率的影响，将样品待净化液分别调节至pH 1，2，3，5，7和9后，过柱净化，回收率如图4所示。结果显示，pH 2时，回收率较高；pH 1时，回收率与pH 2时的回收率相当，随着pH升高，回收率逐渐下降，在酸性条件下，纽甜带上正电荷，更易与柱子固定相结合，且更能有效地去除干扰杂质，从而能够提高目标物的回收率。考虑到环保因素及试验的操作简便性，选择上样液pH 2。

图4 上样液pH对纽甜回收率的影响

2.1.4 洗脱条件的优化

由于PRiME MCX柱基于强阳离子交换和反相吸附的功效，洗脱液选用含5%氨水的甲醇，将目标物从SPE柱上有效地洗脱下来，试验考察洗脱液体积对纽甜回收率的影响，在净化时，分别用1，3，5，7和9 mL含5%氨水的甲醇洗脱，纽甜回收率如图5所示。结果表明，洗脱液体积5 mL时，目标物被完全洗脱，继续增大洗脱液体积，氮吹浓缩时间延长，而回收率略有下降，因此，确定洗脱液体积为5 mL。

图5 不同体积洗脱液对纽甜回收率的影响

2.2 色谱条件的选择

试验比较XBridge C18和Atlantis T3色谱柱对样品中纽甜的分离，结果发现在分离复杂基质样品中纽甜时，Atlantis T3的保留更强，更易于目标物和杂质的分离，因此，选用Atlantis T3色谱柱进行检测，由于纽甜的最大吸收波长在210 nm左右，而甲醇的截止波长210 nm左右，乙腈的截止波长为190 nm左右，在用DAD检测器检测时，乙腈能降低基线噪音，减少干扰，且洗脱能力较强。因此，选用乙腈作为流动相。试验比较0.1%磷酸水溶液、0.1%乙酸水溶液体系作为流动相分离目标物，由于试验中涉及的基质较复杂，含有较多杂质，采用梯度洗脱条件可以提高目标物分离度、改善峰形，而用乙酸溶液进行洗脱时，基线漂移较严重，磷酸溶液作为流动相，基线较稳定，在低波长下，产生的基线波动较小，因此，采用含0.1%磷酸的水溶液作为流动相。在此色谱条件下，纽甜的标准物质色谱图、阳性样品色谱图见图6和图7。

图6 纽甜标准溶液（5 μg/mL）的高效液相色谱图

图7 阳性样品的高效液相色谱图

2.3 方法的线性范围和检出限

以纽甜标准工作溶液质量浓度为横坐标，以响应峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，在0.5～100.0 μg/mL的质量浓度范围内，回归方程为y=0.2497x+0.0018，线性相关系数为0.9999，线性良好。以信噪比S/N为3计算得到检出限，结果为0.06 mg/kg，以信噪比S/N为10计算得到定量限，结果为0.2 mg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

按上述条件进行空白样品的添加回收率和精密度试验，所得到的平均回收率及相对标准偏差结果见表3。

表3 添加回收率与精密度（n=6）

结果表明，纽甜的平均回收率在90%～96%，δRSD在0.9%～1.9%，该方法能够满足实际样品的检测需要。

2.5 实际样品分析

采用建立的方法对50批次不同种类市售炒货食品进行纽甜的检测，其中2个批次样品中检出纽甜，分别为五香奶油花生（纽甜含量4.0 mg/kg）和焗盐味瓜子（纽甜含量10 mg/kg），均低于GB 2760—2014中规定的限量要求。

3 结论

建立高效液相色谱结合固相萃取法检测高油脂植物源性食品中纽甜含量的分析方法。以甲醇水溶液为提取剂对样品中的纽甜进行提取，通过考察不同固相萃取净化方法的效果，最终选用PRiME MCX固相萃取柱来净化样品提取液，经Atlantis T3色谱柱分离，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行检测，方法操作简便，净化效果好，回收率高，减少杂质干扰，适用于不同种类高油脂植物源性食品中纽甜的检测，具有普适性，提高结果准确性和稳定性，用于实际样品的检测，结果令人满意，可为政府监管提供技术支撑，为复杂基质食品中纽甜的检测提供良好的方法参考。