黑小麦芽抗氧化活性成分提取及其抗氧化能力研究

刘瑞，于章龙 ，孙元琳，何永吉，周素梅，张慧林

1.运城学院生命科学系/特色农产品加工山西省重点实验室（运城 044000）；2.山西农业大学棉花研究所（运城 044000）；3.山西农业大学山西功能食品研究院（太原 030031）；4.中国农业科学院农产品加工研究所（北京 100193）

现代营养学研究表明，食物的天然颜色与其营养功能密切相关，颜色愈深，其营养愈丰富，结构愈平衡合理[1]。黑色食品与普通食品相比，不但具有较高的营养价值，而且富含抗氧化物质，可改善体质，延缓衰老。黑小麦以其自然性、营养性、功能性和科学性愈来愈受到人们的关注。黑小麦麦粒中含有丰富的淀粉、脂肪、蛋白质、多种维生素、食物纤维、大量矿质元素和稀有微量元素，黑小麦麦粒中14%～20%含蛋白质[2]；18种氨基酸总含量高于普通小麦40%；赖氨酸含量为0.4%，高于普通小麦50%左右[3]。研究表明，黑小麦中含有黄酮、多糖和多酚等多种活性成分物质，在清除自由基、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂降血压、降低血糖等方面表现出十分多样的药理活性作用[4-6]。随着“健康中国战略”的实施，人类对食品的生理功能和营养价值要求越来越高，而发芽谷物因其营养价值提高、功能成分富集以及原有害物质或抗营养物质降低或消除等多种有利变化，发芽谷物的开发利用正在引起国内外广泛关注并成为研究热点[7-8]。通过多种有机溶剂，复配出不同极性的提取剂，对黑小麦芽进行萃取，并对黑小麦芽提取物中的总酚进行测定，通过不同的体外抗氧化活性评价方法评价提取物的抗氧化活性，通过相关性分析筛选出具有较高活性的组分，为后期分离纯化提供研究基础。本研究为黑小麦综合应用于疾病的辅助治疗和膳食营养提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

运黑14207种子，由山西农业大学棉花研究所提供；福林酚试剂（Folin-Ciocalteu），美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

SCIENTZ真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JYL-C010干磨粉碎机，九阳股份有限公司；101型电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；KS-100AL超声波清洗机，深圳洁康洗净电器有限公司；RE-2000B旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UV-9000S型可见-紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

称取100 g运黑14207种子，用300 mL蒸馏水在25℃下浸泡8 h。捞出沥干，均匀铺洒在底部有孔的发芽盒中，于25 ℃暗处发芽，发芽期间每天浇水3次，每次浇水量为300 mL，待麦芽长约为2 cm时结束发芽。将收获的麦芽装于自封袋中，置于-80 ℃的冰箱中冷冻24 h，然后进行真空冷冻干燥24 h。将干燥好的麦芽置于干磨粉碎机中粉碎处理，麦芽粉装于自封袋中于4 ℃的冰箱冷藏备用。

1.2.2 溶剂配制及萃取

分别配制50%，75%和100%乙醇、甲醇和丙酮溶液，以蒸馏水为对照。称取10 g麦芽粉，与提取溶剂按照料液比1∶10（g/mL）混合，在40 kHz功率超声波辅助提取30 min，期间用玻璃棒间歇搅拌，经抽滤，将滤液置于旋转蒸发仪中除去有机溶剂，获得提取液，并置于平面皿中，真空冷冻干燥，称其质量并计算得率（Extract yield，EY）。冻干样品密封包装4℃冷藏备用。

式中：冻干样质量，g。

1.2.3 提取物中总酚测定

总酚（TP）测定采用Folin-Ciocalteu试剂法[9]，结果以每毫升溶液中没食子酸（GAE）当量表示样品中总酚。准确移取100 μL样液、500 μL菲林试剂和6 mL蒸馏水于试管中，以1400 r/min振荡1 min，对照样为纯水。然后加入2 mL 15% Na2CO3溶液，继续以1400 r/min振荡0.5 min，然后用蒸馏水定容至10 mL。避光静置2 h，然后在750 nm处测定吸光度。以没食子酸作标准曲线，并求得回归方程y=0.001x+0.0228（R2=0.9963）。式中，x为没食子酸质量浓度（mg GAE/mL），y为吸光度。

总酚提取能力（TPEC），即溶剂提取总酚的能力，按式（2）进行计算。

1.2.4 提取物对DPPH自由基清除能力测定

提取物的DPPH自由基清除能力测定参考Zhu等[10]方法，并稍作改进，清除能力以半数抑制率IC50值计。将DPPH用75%乙醇配制成0.04 mg/mL溶液，将样品用75%乙醇分别配制成0.3，0.6，1.2，1.8，2.4和4 mg/mL的溶液，然后将两者等比例混合，避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度。样品对DPPH清除率I按照式（3）计算。

式中：A为样品的吸光度；A1为阳性空白（无DPPH溶液）的吸光度；A0为阴性空白（无样品溶液）的吸光度。

抗氧化物提取能力（AECDPPH）按照式（4）计算，其含义为用DPPH法评价该溶剂对样品中抗氧化物的提取能力，其值越高，说明该溶剂提取抗氧化物能力越强。

1.2.5 提取物对ABTS自由基清除能力测定

ABTS自由基清除能力测定参考Re等[11]方法，并稍作修改。取20 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液和0.352 mL 140 mmol/L过硫酸钾水溶液混合避光过夜放置，然后用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）将混合液稀释至吸光度=0.700±0.002，制备得到ABTS自由基溶液。取6 mL ABTS自由基溶液，分别与4 mL不同质量浓度（30，60，120，180，240和400 μg/mL）的样品液混合，静置6 min后，在420 nm处测定吸光度。清除率、IC50（ABTS）和AECABTS计算方法同1.2.4小节。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件分析数据，得到半数抑制率IC50值，采用邓肯氏方差分析判定差异显著性（p＜0.05），相关性分析采用Pearson模式。

2 试验结果及分析

2.1 不同溶剂对麦芽提取物得率的影响

溶剂提取是天然产物分离提取中较为常用的方法，即根据相似相溶的原理，从原料中提取极性与之相近的物质，然后除去溶剂得到纯物质。研究采用不同极性的溶剂对原料进行一次性提取，可从原料中筛选出某种极性的物质。得率体现了某种溶剂可提取出的可溶性物质的多少，得率高则提示样品中易溶于该溶剂的物质成分含量较高[12]。从图1可以看出，蒸馏水提取物得率为18.77%，显著高于其余有机溶剂提取物得率（p＜0.05），50%甲醇组次之，100%丙酮组最低，为2.08%。强极性溶剂提取得率比弱极性高，因为黑小麦发芽过程中可溶性蛋白、总氨基酸和必需氨基酸的浓度增加，这与张雨薇等[13]探讨发芽对荞麦蛋白质和氨基酸的影响结果一致。而对于极性较弱的丙酮溶剂，只有少量的油脂和叶绿素溶出，所以其得率最低。

图1 不同溶剂对麦芽提取物得率的影响

2.2 不同溶剂对麦芽提取物总酚及总酚提取能力的影响

总酚（TP）是以没食子酸当量体现总酚的质量分数。从图2可以看出，在10种溶剂提取物中，100%乙醇提取物中总酚的质量分数最大，为3.8 mg GAE/100 mg，50%甲醇提取物次之，50%丙酮提取物总酚的质量分数最低，为1.95 mg GAE/100 mg。由此可知，黑麦芽中多酚具有较高极性。Szwajgier等[14]研究表明，小麦发芽后酚酸含量，特别是阿魏酸含量显著增加。且一般而言，具有较高极性的溶剂提取酚类化合物的效率也更高[15]。

图2 不同溶剂对麦芽提取物总酚质量分数的影响

总酚提取能力是结合得率和提取物中总酚质量分数考察溶剂的提取效果。从图3可以看出，对比10种溶剂对麦芽的总酚提取能力的影响，75%乙醇处理组黑麦芽总酚提取能力最高，为41.07，且75%乙醇、50%甲醇和蒸馏水对黑麦芽总酚提取能力的影响无显著性差异（p＞0.05）。100%丙酮处理组黑麦芽总酚提取能力最小，为5.82。Gan等[16]对发芽黑小麦的研究结果表明，发芽3～8 d可显著提高黑小麦可溶性和结合性提取物的抗氧化活性和总酚质量分数，可溶性提取物主要是黄酮类，结合性提取物主要是阿魏酸和香豆酸。

图3 不同溶剂对麦芽样品总酚提取能力的影响

2.3 不同溶剂对麦芽提取物DPPH自由基清除能力及抗氧化物提取能力的影响

DPPH自由基是一种稳定的以氮原子为中心的自由基，若样品能将其清除，则提示样品具有降低自由基有效浓度，以及中断脂质过氧化链式反应的作用[17]。DPPH自由基清除率以IC50值表示，其值越低，表明自由基清除能力越强。由图4可以看出，纯有机溶剂提取物均表现出较强的DPPH自由基清除能力，且显著高于其余处理组（p＜0.05），且此次研究中不同体积分数的甲醇和乙醇溶液所对应的提取物表现出高于蒸馏水提取物的DPPH自由基清除能力（p＜0.05）。前人研究也表明，60%乙醇处理的花生壳提取物DPPH自由基清除率高于蒸馏水处理组[18]。

图4 不同溶剂对麦芽提取物DPPH自由基清除能力的影响

抗氧化物提取能力（AECDPPH）是综合得率和提取物DPPH自由基清除能力评价不同溶剂对抗氧化物的提取效果，其值越高，表明溶剂对抗氧化物的提取效果越好。由图5可以看出，10种溶剂中75%乙醇提取物的AEC值较高，为11.37，说明其提取效果较好。75%乙醇与蒸馏水对黑麦芽抗氧化物的提取效果的影响无显著性差异（p＞0.05）。

图5 不同溶剂对基于DPPH法评价抗氧化物提取能力的影响

2.4 不同溶剂对麦芽提取物ABTS自由基清除能力及抗氧化物提取能力的影响

在有供氢能力的抗氧化剂（如酚类物质）存在下，ABTS自由基与之反应，变成没有颜色的ABTS。ABTS自由基脱色试验是一种用于评价生物样品抗氧化活性的方法[19]。ABTS自由基清除能力以IC50值表示，其值越低，表明ABTS自由基清除能力越强。由图6可以看出，10种溶剂中100%甲醇提取物ABTS自由基清除率较高，其IC50值为0.05 mg/mL，50%乙醇次之。可知100%甲醇和50%乙醇提取物ABTS自由基清除能力较强。

抗氧化物提取能力（AECABTS）是以ABTS法评价不同溶剂对黑麦芽抗氧化物的提取能力，其值越高，表明提取效果越好。由图7可以看出，10种溶剂中50%乙醇对基于ABTS法的抗氧化物的提取能力较强，AEC为170.00，且50%乙醇、75%乙醇和蒸馏水组的AEC值无显著性差异（p＞0.05）。结合图6可知，基于ABTS评价方法，50%乙醇提取物ABTS自由基清除能力较高，且抗氧化物提取能力也较强。

图6 不同溶剂对麦芽提取物ABTS自由基清除能力的影响

图7 不同溶剂对基于ABTS法评价抗氧化物提取能力的影响

2.5 相关性分析

为了研究黑小麦麦芽提取物多酚质量分数及抗氧化性之间的关系，对各项指标进行相关性分析，结果如表1所示。总酚质量分数（TP）与总酚提取能力（TPEC）具有显著相关性，TP与DPPH、ABTS清除率都具有显著的负相关，说明黑小麦芽多酚具有明显的抗氧化作用。此研究结果与Siddhuraju等[20]研究结果一致。此外，TP与AECDPPH具有显著的相关性，说明提取物的抗氧化性主要来源于多酚，TPEC与AECDPPH具有显著的正相关，说明溶剂对总酚提取能力的水平与对抗氧化物质提取能力一致，此研究结果与Chen等[21]研究结果一致，且考虑到DPPH法操作简单、方便快捷，因此更适于黑小麦麦芽提取物抗氧化活性的评价。

表1 相关性分析

3 结论

对运黑14207黑小麦芽的不同极性提取物的得率、总酚质量分数、抗氧化能力和相关性分析进行研究。在10种溶剂中，75%乙醇处理组黑小麦芽多酚类物质提取能力较高，且与蒸馏水处理组之间无显著性差异（p＞0.05）。基于DPPH自由基清除能力，纯有机溶剂提取物对DPPH自由基清除率较高，就抗氧化物提取能力而言75%乙醇组最高（11.37），且与蒸馏水处理组之间无显著性差异（p＞0.05）。基于ABTS自由基清除能力，100%甲醇溶剂提取物和50%乙醇溶剂提取物对ABTS自由基清除率较强，其ABTS IC50值分别为0.05和0.058 mg/mL，就抗氧化物提取能力而言，50%乙醇组最高（170.00），且与蒸馏水处理组之间无显著性差异（p＞0.05）。综上比较，考虑到蒸馏水的成本低、安全性高，且对于总酚及抗氧化物质的提取能力均较高，故其更适合作提取剂。根据相关性分析，酚类物质对黑小麦芽提取物的抗氧化性起主导作用，DPPH法更适合作为评价黑小麦芽提取物抗氧化能力的快速检测方法。