响应面法优化提高药桑叶绿茶中γ-氨基丁酸质量分数的杀青工艺

郭红梅，梁雎，刘志刚，李海峰，胡西旦·买买提，任红松

新疆农业科学院吐鲁番农业科学研究所（吐鲁番 838000）

药桑（medicine mulberry）属蔷薇目（Rosales）桑科（Moraceae）桑属（MorusL.）黑桑种（M.nigraL.）[1]，是新疆珍稀的药食兼用桑树品种资源，体细胞染色体倍数为22倍体[2]。与其他桑叶品种相比，药桑含有更高的营养成分和次生物质药理活性[1]。桑叶绿茶是我国桑叶食品加工的主要形式，可有效保存桑叶的风味和营养成分[3]。其中，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是桑叶中重要的活性成分[4]，是动物中枢神经系统的一种重要的抑制性神经递质，具有降血压、提高肝肾功能、抗衰老、抗疲劳、促进睡眠、治疗糖尿病等作用[5-9]。同时γ-氨基丁酸是一种与逆境胁迫有关的非蛋白氨基酸，在吐鲁番极端高温干燥的胁迫下，可导致其大量生成[10]。20世纪80年代，日本开发出了高质量分数GABA的绿茶，并将茶叶中GABA在1.5 mg/g以上称为GABAron茶，同时具有茶叶和GABA的保健功效[11]，在日本形成了稳定的消费群体[12]。在我国GABA茶发展迅速，具有广泛的市场前景[12]。边伟等[13]研究了对不同杀青方式制备高质量分数GABA桑叶茶的影响。黄亚辉等[14]制备了达GABAron茶标准的茗丰茶，并开展临床降压试验，取得了非常显著的降压效果。Chen等[15]利用采自台湾的青心乌龙茶制备了高质量分数GABA（3 mg/g）茶叶，提出此GABA茶可降低高血压引起的心脏异常。王子瑞等[16]以大叶种茶鲜叶为主要原料，加工成γ-氨基丁酸普洱茶，GABA质量分数达到2.5 mg/g以上。

桑叶茶加工工艺主要继承茶叶加工工艺，难以体现桑叶绿茶的品质特征，有针对性的工艺研究仍有很大空间[17-18]。孙庆磊等[19]指出鲜叶品质（老嫩、含水量）、温度、时间、投叶量是绿茶杀青工艺的主要影响因素。其中杀青前的鲜叶含水量由摊放阶段决定。倪德江等[20]认为鲜叶摊晾的时间为5～8 h，边伟等[13]试验认为摊放3 h以上，内含物质充分水解，摊放叶的水浸出物浓度有明显的升高。叶玉龙[21]认为生产中以鲜叶含水量至70%左右为摊放适度。

滚筒杀青是国内应用最为广泛的方式，能大规模连续机械运作，生产应用较多。但滚筒杀青对人工操作技术的要求很高[22]，制茶工序关键参数待挖掘[23]。王彬等[24]在以杀青时间为单因素的试验中，一次大量投叶。张启利等[25]指出6CS-40型滚筒杀青机从进叶到出叶的时间为60 s，在制茶实践中是保证鲜叶杀青匀透的最少时间。杨秀荣[26]结合茶叶内含物质检测分析与感官评审结果，认为最佳杀青条件为140 ℃，55 s。范作卿等[27]试验总结出滚筒杀青255 ℃，30 s得到的桑叶茶DNJ浓度最高。倪德江等[20]认为滚筒杀青应在固定杀青温度的条件下，匀速小撮投叶，使鲜叶在滚筒的翻滚、抛洒、推进中均匀地吸收热量、蒸发水分，达到鲜叶迅速萎软杀熟的目的。

经厌氧处理的GABA茶因为有明显的异味限制其推广[12]，现行茶叶质量标准常综合桑叶活性物质指标和感官评定的结果来评价[13,26]。为挖掘吐鲁番市桑树资源，选取吐鲁番地产和引种栽培的主要桑树品种为试验材料，结合吐鲁番药桑叶品质特点，以杀青温度、杀青时间、鲜叶含水量和投叶量为因素，研究药桑叶绿茶GABA的形成及茶叶感观品质的最优滚筒杀青参数，旨在制备兼顾高质量分数GABA和感观品质的药桑绿茶，促进桑叶茶产业化发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样本

药桑鲜叶由吐鲁番市现代农业示范园区提供，2019年5月采摘，选取从顶芽向下2～6片新鲜桑叶。

1.1.2 仪器与设备

6CS-40型滚筒杀青机、6CR-40型揉捻机（浙江绿峰机械有限公司）；6CCGQ-50双锅曲毫炒干机（浙江上洋机械有限公司）；EL-PH7.0 pH计（厦门恩莱自动化科技有限公司）；离心机Sigma3K15（德国）；TLG-01样品粉碎机（北京天利恒诚科技有限公司）；JA1203B电子天平（上海菁海仪器有限公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴（北京市永光明医疗仪器有限公司）；UV754N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DHG-9070电热恒温干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）；水分测定仪（上海禾工科学仪器有限公司）；比色皿、移液管、台秤（精度g）、秒表、茶样罐等。

1.1.3 主要试剂

硼酸、重蒸酚、三氯化铝、GABA标准样品，上海麦克林生化科技有限公司；丙酮，天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钾，天津永晟精细化工有限公司；甲醇，北京化工厂；乙醇，天津市北联精细化学品开发有限公司；所有试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 摊放工艺处理

试验在吐鲁番市高昌区室温25～30 ℃条件下摊放，相对湿度32%～35%。鲜叶摊放厚度3～5 cm，每0.5 h翻匀一次，抖去叶片水分，于不同时段（0，1，2，3，4，5，6和7 h）取样测定鲜叶含水量及GABA质量分数。用隶属函数法[28]对测定的数据进行标准化，消除不同指标间量纲差异。

式中：Xij为第i个样品第j个指标的检测值；Xmax和Xmin分别为第j项指标的最大值和最小值；Yij为经转化后的隶属函数值；将各指标的隶属函数值作为原始值进行综合评价。综合GABA质量分数和鲜叶含水量的隶属函数值计算综合评分。权重分配GABA质量分数占0.5，含水量占0.5。

1.2.2 杀青工艺处理

1.2.2.1 杀青标准的及各因素水平的确定

以杀青叶叶色暗绿、青草气消失而具有香气、叶脉折而不断、叶质柔软、紧握成团及松手散开为感官品质依据，考察不同杀青条件下的各因素水平。在杀青时间单因素试验中，将1.2.1小节优化处理之后的材料称取5 kg一次性投叶，考察在固定温度下不同处理时间的杀青质量。采用二次杀青的方法延长杀青时间，在达到考察的杀青时间时改变滚筒倾角提前出叶。在杀青温度和投叶量单因素试验中，采用均速小撮的方式投叶，达到杀青匀透的目的。

1.2.2.2 杀青工艺对药桑叶绿茶GABA质量分数影响的单因素试验

将1.2.1小节优化处理之后的材料混匀进行滚筒杀青处理。得到杀青工艺处理参数：杀青温度（固定条件：投叶量36 kg/h，杀青时间160 s）230，240，250，260和270 ℃；杀青时间（固定条件：杀青温度240 ℃，投叶量36 kg/h）100，130，160，190和220 s；投叶量（固定条件：杀青时间160 s，杀青温度240℃）24，30，36，42和48 kg/h。杀青结束后按绿茶标准工艺加工成茶，对试验样品进行感观评审和GABA质量分数测定。用1.2.1 小节中的隶属函数法对测定的数据进行标准化，综合GABA质量分数和感官评分的隶属函数值计算综合评分。权重分配GABA质量分数占0.5，感官评分占0.5。

1.2.2.3 响应面试验

通过单因素试验，确定响应面试验设计的因素和水平。采用中心组合试验Box-Behnken试验设计，选取3个主要影响因子的水平为自变量，以其药桑叶绿茶综合评分为响应值，采用三因素三水平的响应面法设计试验，得出药桑叶绿茶的最优杀青工艺，并验证模型预测的有效性。响应面试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平及编码

1.2.3 检测方法

1.2.3.1 GABA质量分数

γ-氨基丁酸质量分数采用夏玉玲等[29]的方法。

1.2.3.2 感官评分

感官品质评定按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》[30]的要求进行，评价药桑叶茶的感官品质。由10位鉴评专业人员组成鉴评小组，分别称取3 g药桑叶茶，加入150 mL沸水冲泡4 min，倒出茶汤，依次评审药桑叶茶的干茶外形、汤色、香气、滋味、叶底。各项目以100分计，总分参照茶叶审评加权法计算，按照外形25%、香气25%、汤色10%、滋味30%、叶底10%、计算总分，取平均值。

1.3 数据处理

数据处理和图表绘制使用Microsoft Excel 2010与Design-Expert.V 8.0.6.1，方差分析使用SPSS 19.0。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 摊晾时间对药桑叶绿茶综合评分的影响

由图1可以看出，摊晾时间小于3 h，综合评分随着摊晾时间的增加而逐渐升高；大于3 h时，综合评分随着摊晾时间的增加而逐渐降低。主要是由于当摊晾时间较短时，叶片内含物质水解不充分。叶片含水量高，杀青叶具有水闷气，从而影响杀青叶质量。当摊晾时间超过3 h时，叶片大量失水，以致杀青叶叶缘干枯卷曲，造成后期揉捻中叶片断碎，成型困难。因此，选择摊晾时间3 h为适宜的条件。

图1 摊晾时间对药桑绿茶综合评分的影响

2.1.2 杀青温度对药桑叶绿茶综合评分的影响

由图2可知，当杀青投叶量和杀青时间为定值（36 kg/h，160 s）时，综合评分随着杀青温度的增加而增大。当杀青温度为240 ℃时，综合评分出现最大值，随后继续提高杀青温度，综合评分逐渐降低。这是因为杀青温度在230～270 ℃范围内，随着杀青温度的升高，叶片感观品质得到提高，茶汤更加鲜醇浓郁，香气显露。当杀青温度超过260 ℃时，杀青叶略显硬脆，感观综合评分开始下降。随着杀青温度的升高，内含物质GABA逐渐降低。因此，选取杀青温度230，240和250 ℃ 3个水平进行响应面试验。

图2 杀青温度对药桑绿茶综合评分的影响

2.1.3 杀青时间对药桑叶绿茶综合评分的影响

由图3可知，当杀青温度和投叶量为定值（240℃，36 kg/h）时，综合评分随着杀青时间的延长而增大。当杀青时间为160 s时，综合评分出现最大值，随后继续延长杀青时间，综合评分呈现逐渐降低的趋势。这是因为随着杀青时间的延长，杀青更加充分，杀青叶萎软暗绿，感观润泽，香气高强。感官评分也随之提高，当杀青时间超过为190 s时，杀青叶含水量过低，感观评分逐渐降低。随着杀青时间的延长，内含物质GABA的质量分数先升高后逐渐降低。当杀青时间为160 s时，GABA质量分数达到峰值。因此，选取杀青时间130，160和190 s 3个水平进行响应面试验。

图3 杀青时间对药桑绿茶综合评分的影响

2.1.4 投叶量对药桑叶绿茶综合评分的影响

由图4可知，当杀青温度和杀青时间为定值（240℃，160 s）时，综合评分随着投叶量的增大而提高。当投叶量为36 kg/h时，综合评分出现最大值，随后继续增大投叶量，综合评分呈现逐渐降低的趋势。这是因为随着投叶量的增加，杀青叶青绿色消失，叶片柔软有清香。当投叶量超过42 kg/h后，叶片出现花杂，熟叶中夹杂青绿叶，杀青不均不透，感观评分也随之降低。随着投叶量的升高，内含物质GABA的质量分数先升高后逐渐降低，当投叶量为36 kg/h时，GABA质量分数达到峰值。因此，选取投叶量30，36和42 kg/h 3个水平进行响应面试验。

图4 投叶量对药桑叶绿茶综合评分的影响

2.2 药桑叶综合评分响应面法试验

2.2.1 药桑叶综合评分拟回归模型的建立

按照中心组合设计试验方案进行三因素三水平试验，试验结果见表2。将所得的试验数据采用Design-Expert软件进行多元回归拟合，得到以GABA为目标函数的二次回归方程：Y=0.87-0.054A+5×10-3B+6.25×10-3C+0.015AB-2.5×10-3AC+0.09BC-0.08A2-0.053B2-0.13C2。

表2 响应面法试验设计与结果

2.2.2 试验结果的方差显著性分析

由表3可以看出，回归模型方差分析表明回归模型显著（p＜0.01），回归模型系数的显著性检验结果R2为0.9977，说明此模型与数据拟合度很高。方差分析表中失拟p值为0.6507，大于0.05，说明此模型可以充分解释响应中的变异，模型拟合度很高，试验误差小。可以用此模型对滚筒杀青制取药桑叶绿茶的综合评分进行分析和预测。

表3 回归模型方差分析

在该模型中，模型项F值为339.48，说明该模型是有意义的。由表3数据可知，在一次项中A（杀青温度）为显著，在交互项中AB和BC存在显著交互作用，在二次项中A（杀青温度）、B（杀青时间）和C（投叶量）的二次项表现为极显著，表明杀青温度、杀青时间和投叶量之间的相互作用对综合评分有一定影响，交互作用显著。由F检验结果的显著性分析可知，各因素对反应的贡献率，影响显著性由大到小依次为A＞C＞B，即杀青温度＞投叶量＞杀青时间。

2.2.3 响应曲面分析

杀青温度、杀青时间、投叶量及其交互作用对响应值的影响如图5～图7所示。

图5 杀青温度和杀青时间对综合评分影响的等高线与响应面图

图6 杀青温度和投叶量对综合评分影响的等高线与响应面图

图7 杀青时间和投叶量对综合评分影响的等高线与响应面图

由图5可以看出，当投叶量一定时，药桑叶绿茶的感官评分随杀青温度的升高和杀青时间的增加先升高后降低。由图6可以看出，当杀青时间一定时，随着另外两个因素的变化，药桑叶绿茶感官评分呈现先不断增加后下降的趋势。由图7可以看出，当杀青温度一定时，药桑叶绿茶的感官评分随杀青时间和投叶量的增加呈现升高后降低的趋势。

运用Design-Expert 8.0.5软件对试验结果进行优化分析，滚筒杀青制取高质量分数GABA药桑叶绿茶的最佳条件为杀青温度236.65 ℃、杀青时间145.49 s、投叶量33.11 kg/h。在此条件下预测的感官评分为0.88。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行重复试验，根据实际生产条件，将工艺条件修正为杀青温度240 ℃、杀青时间145 s、投叶量33 kg/h。在最佳工艺下制备的药桑叶绿茶汤色黄亮，滋味鲜醇，清新宜人。综合评分实际值为0.89分GABA质量分数达4.2 mg/g，比加工前的3.3 mg/g增加了27.27%，达到了高质量分数GABA绿茶的标准，具有一定的保健作用。

3 结论

通过单因素试验和应用Box-Behnken试验设计和响应面分析法建立的二次回归模型，对数据进行分析，得出高质量分数药桑叶绿茶杀青的最佳工艺条件：杀青温度240 ℃、杀青时间145 s、投叶量33 kg/h。试验结合茶叶GABA质量分数检测分析与感官评审结果，研究了影响桑叶绿茶GABA的质量分数茶叶感观品质的加工参数，制备了兼顾高GABA质量分数和感观品质的桑叶绿茶，为药桑叶绿茶的实际生产提供了一定的依据。