莱芜干烘茶中咖啡因提取方法及浓度测定的优化

曹峰

济南市食品药品检验检测中心（济南 250102）

莱芜干烘茶是莱芜特产，创始于明朝隆庆年间，原产于安徽省六安、霍县一带，后传入莱芜地区，距今已有400多年的历史。莱芜干烘茶属半发酵茶，其汤色橙红，口味苦中带涩，甘醇悠长，深受当地民众喜爱。咖啡因又名咖啡碱，是茶叶中的重要成分，作为一种中枢神经兴奋剂，临床上用于治疗神经衰弱，但是大剂量或长期使用会对人体造成危害[1]，如影响睡眠，降低女性受孕率，严重者会损害肝、胃、肾等重要器官[2]，特别是它有成瘾性，一旦停用会出现精神萎靡、浑身困乏疲软等症状[3-4]，因而国家制定了相应的卫生标准。

咖啡因的浓度是衡量茶叶品质的一项重要指标[5]，因此准确测定咖啡因的浓度对确保茶叶质量及开发利用我国丰富的茶叶资源具有十分重要的意义。目前测定咖啡因的方法有薄层色谱法、紫外分光光度法、气相色谱法和高效液相色谱法等[6-7]，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏度高、重现性好等优点[8]，应用较多。

醇提法及二氯甲烷等有机溶剂提取法是从茶叶中提取咖啡因的两种常用方法，醇提法一般使用乙醇溶液为溶剂，使用索氏提取器蒸馏提取或者直接加热浸提[9]，前者需连续提取2～3 h[10]，耗时较长；二氯甲烷等有机溶剂提取法需使用大量二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮等对人体有害且易污染环境的有机试剂，并需蒸馏、水浴回收、抽滤等操作步骤[11-12]，不利于日常检测。尽管国标方法[13]对样品处理过程进行了改进优化，采用水为提取溶剂，使用氧化镁沉淀茶叶中的单宁酸等物质，但处理过程需用沸水浴提取2次，不时振摇并用流水冷却，操作繁琐，耗时长，且提取率较低[10]。针对这些问题，为提高提取率、简化提取工艺，参考国标方法及相关文献[1,6,8-13]并略加改进，以70%乙醇溶液为溶剂，对加热振荡提取、超声提取及微波萃取3种方法的提取效果进行研究，并对测定莱芜干烘茶中咖啡因的高效液相色谱法进行优化，为莱芜干烘茶的检验检测及进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

U3000高效液相色谱仪（配VWD-3100紫外检测器），美国Thermo Fisher公司；UV-2700紫外可见分光光度计，日本岛津公司；MARS 6 CLASSIC微波萃取仪，美国CEM公司；LTB-800数控超声波清洗机，济宁鲁通超声电子设备有限公司；TDZ5-WS台式离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；SHA-C水浴恒温振荡器，江苏金怡仪器科技有限公司。

咖啡因标准品（≥99.8%），德国DR公司；无水乙醇（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；甲醇、乙腈（均为色谱纯），山东禹王和天下新材料有限公司；氧化镁（分析纯），天津金汇太亚化学试剂有限公司；莱芜干烘茶，山东五福茶业有限公司；测试用水为娃哈哈纯净水。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Acclaim120 C18柱（4.6 mm×150 mm，粒径5 μm）；流动相：甲醇-水（25∶75，V/V）；流动相流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：275 nm；进样量：10 μL。

1.3 干烘茶样品的处理

将干烘茶样品低温干燥后粉碎，过0.600 mm孔径筛，精确称取茶叶样品和氧化镁置于具塞三角瓶及微波萃取管中，分别加入不同体积分数的乙醇溶液作为提取剂，涡旋混匀后分别采用加热振荡提取、超声提取及微波萃取3种方法提取样品中的咖啡因。将得到的提取液以5000 r/min离心15 min，移取全部上清液于容量瓶中用纯水定容，经有机相针式滤器过滤后上机测试。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的研究确定

2.1.1 检测器波长的确定

将50 mg/L咖啡因标准品溶液用岛津紫外分光光度计进行光谱扫描，绘制吸收曲线，以确定咖啡因的最大吸收波长，结果见图1。

图1 咖啡因标准品溶液吸收曲线

从吸收曲线可以看出咖啡因在275 nm处吸收波长最大，与丁瑞芳等[7]的研究结果一致。由于在最大吸收波长条件下检测，杂质干扰少，比较灵敏且稳定性好，因此确定275 nm为测定波长。

2.1.2 流动相组成及比例的确定

在国标方法[13]基础上并参照相关研究[1,2,7]，考察甲醇和乙腈两种有机相分别与水以不同体积比混合作为流动相时对目标峰与杂质峰的分离效果的影响，结果显示在两种有机相下目标峰与杂质峰分离良好并且均能得到较好的峰形。由于甲醇的毒性相对要小，因此选择甲醇-水作为方法的流动相。

将甲醇-水两相在不同体积比（10∶90，20∶80和25∶75）条件下对干烘茶提取液进行测定（紫外波长275 nm，柱温为30 ℃），结果发现两相的体积比在10∶90时咖啡因出峰时间约为18 min，体积比在20∶80时咖啡因出峰时间在7 min左右，但体积比为25∶75时咖啡因能在5 min内出峰，目标峰与杂质峰能完全分离，色谱峰峰形较好，为提高检测效率，研究采用甲醇与水的体积比25∶75。

2.1.3 色谱柱温度的确定

在25～40 ℃的温度范围内按照1.2的色谱条件每隔5 ℃度测定1次咖啡因标准品溶液，结果发现在此温度范围内柱温对咖啡因色谱峰峰形及保留时间的影响均不显著，由于高温不仅影响色谱柱寿命，还会使各组分的分离度减小，因此选择柱温30 ℃。

在以上确定的色谱条件下，咖啡因标准物质及莱芜干烘茶样品色谱图如图2和图3所示。

图2 咖啡因标准品溶液色谱图

图3 莱芜干烘茶样品色谱图

2.2 咖啡因提取方法的优化选择

目前从茶叶中提取咖啡因的方法根据提取溶剂的不同主要有水提法、醇提法及二氯甲烷等有机溶剂提取法[11]。按照提取方式不同可分为直接加热浸提、超声提取、微波萃取等[14-17]方法。相关研究[10,18]表明相对于使用水及二氯甲烷为提取剂，用乙醇溶液为提取剂更利于咖啡因的提取，因此选择不同体积分数的乙醇溶液为提取溶剂，并将直接加热浸提改进为加热振荡提取，然后将加热振荡提取、超声提取与微波萃取进行比较，以便选择一种较好的提取方法。

2.2.1 加热振荡提取

加热振荡提取是最常用的一种提取方法，简单易行。参照其他研究[9]，称取0.5 g（精确至0.001 g）粉碎的莱芜干烘茶样品及1 g氧化镁各5份放入5只100 mL具塞三角瓶中，分别加入40 mL 50%，60%，70%，80%和90% 5种不同体积分数的乙醇溶液，放入水浴恒温振荡器中，由于常压下乙醇溶液沸点较水低（50%及90%乙醇水溶液沸点分别为81.9和78.5℃），为防止提取过程中乙醇沸腾溢出及减少挥发，造成咖啡因损失，提取温度不宜太高，研究选择水浴温度78 ℃，以30 r/min的速度振荡提取60 min。

2.2.2 超声提取

超声提取是利用超声波机械粉碎和空化作用，以加速提取物向溶剂扩散，提高有效成分提取率的方法[9]。按照2.2.1称取干烘茶样品及氧化镁并加入不同体积分数的乙醇溶液，在功率200 W，78 ℃下超声提取60 min。

2.2.3 微波萃取

微波萃取技术是近期发展起来的一种新型提取技术，具有萃取时间短、试剂用量少、节能高效等优点[19-20]，已被广泛应用于食品、生物样品的分析与提取。

研究的萃取方法参照CEM微波化学（中国）技术中心提供的《MARS微波萃取常用方法》及其他文献并适当改进，称取0.5 g（精确至0.001 g）粉碎的干烘茶样品及1 g氧化镁各5份放入5只萃取管中，分别加入20 mL 2.2.1中5种不同体积分数的乙醇溶液，按照表1方法进行萃取。

表1 微波萃取方法

将以上3种方法提取得到的15组不同提取液以5000 r/min离心，取全部上清液用纯水定容至50 mL，经0.22 μm有机相针式滤器过滤，然后按照优化的检测条件对提取液进行测定，结果如图4所示。

图4 提取方法及乙醇体积分数对咖啡因提取效果的影响

由图4可以看出，提取方法及乙醇体积分数对咖啡因的提取效果有较为显著的影响，在相同茶叶样品的条件下，当乙醇体积分数为70%时，采用微波萃取所得咖啡因的质量分数最高，为23.8 mg/g；当乙醇体积分数为80%时，仍然是微波萃取所得咖啡因质量分数最大，但小于乙醇体积分数为70%时所得，加热振荡法得到的咖啡因的质量分数最小，仅为18.5 mg/g。从以上结果可以看出采用70%乙醇溶液为提取溶剂，以微波萃取的方法的提取效果最好，操作简单且用时最短。因此选择以70%乙醇溶液为提取溶剂，采用微波萃取法提取莱芜干烘茶中的咖啡因。

2.3 咖啡因的线性及方法检出限

将咖啡因标准储备液配制成1.0～150.0 mg/L之间6种不同质量浓度的溶液，依照优化的测试条件进行测定，结果显示在此范围内质量浓度和峰面积线性关系良好。咖啡因的校正曲线见图5，曲线方程、检出限及相对标准偏差（SRSD）等见表2。

图5 咖啡因校正曲线图

表2 校正曲线和检出限

2.4 方法精密度试验

利用微波萃取法提取干烘茶样品中的咖啡因后，按照优化的液相色谱法平行测定样液6次，并计算咖啡因测定值的SRSD及平均值，结果见表3。

表3 咖啡因精密度试验结果（n=6）

结果显示，6次测量值的相对标准偏差（SRSD）为0.46%，干烘茶样品中咖啡因的平均值为23.85 mg/g，说明该方法精密度较好，可以在日常检测中应用。

2.5 方法加标回收率的测定

称取适量茶叶样品，在校正曲线范围内按照表4所示的加标量分别加入不同量的咖啡因标准物质，并依照上述确定的方法处理后进行测定，测定结果见表4。

表4 加标回收试验结果（n=6）

表4结果显示，按照优化的提取方法及测试条件测定莱芜干烘茶中的咖啡因，其加标回收率为97.4%～100.2%，平均回收率为98.6%，相对标准偏差（SRSD）为1.02%，测试结果精确可靠。

3 结论

对3种提取咖啡因的方法进行对比研究，结果表明以70%乙醇溶液作为提取液，氧化镁为沉淀净化剂，利用微波萃取干烘茶中的咖啡因，经离心过滤后直接上机测试，相比加热振荡提取及超声提取，微波萃取法操作更简单，提取率高，耗时少；与其他测定茶叶中咖啡因的高效液相色谱法[1,5,9]相比，该方法前处理工艺简单快捷，分析时间短，加标回收率较高，检出限较好。从以上结果显示该方法提取率高、分离效果好、快速简便、精密度高，符合相关检验检测要求，适用于莱芜干烘茶中咖啡因含量的分析测试。