木枣果蔬酵素发酵工艺优化

贺莹，武宇诗

吕梁学院生命科学系（吕梁 033000）

木枣，属于大枣的一种，主要集中分布在中国的北方地区，是山西、陕西的主要栽培品种。其中，吕梁大枣颇为出名，年产量大，枣果大而色彩斑斓，厚实柔软，性温，富含营养成分和生物活性成分，属于天然保健产品中的一种保健食品，可食用也可药用，具有极高的利用价值，深受广大群众的喜爱[1]。酵素，也可以叫作是“酶”，酵素是用各种同种或者不同的动植物材料作为原料，应用不同的微生物，在特定的条件下进行发酵工艺，所产生的具有一定生物活性的物质。它的这些活性都是通过选取的原材料，微生物营养物质，还有一些经过发酵的过程中所产生的。植物酵素具有润肠通便[2]、解酒保肝[3]等功效。我国关于酵素产品的研究尚处于初级阶段，市场发展也才刚刚起步。

以木枣为原料，选用酵母菌和植物乳杆菌作为菌种，制备木枣酵素。选取不同的发酵时间、发酵温度、接种量、菌种比例等因素设计单因素试验，以超氧化物歧化（SOD）酶活力的大小为指标，进行分析研究，以期提高木枣的加工利用率和酵素产品的多样性，同时对果蔬酵素产品的研究提供可行的技术指导和理论依据[4-5]。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料及药品

木枣：太原万果山电子商务有限公司；安琪牌活性干酵母，购于河南万邦实业公司；植物乳杆菌，购于河南万邦实业公司；果胶酶，购于浙江仁和生物科技有限公司；酵母膏粉，购于天津市光复精细化工研究所。

1.1.2 仪器与设备

DFT-100手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；RE-5298旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）；CPA225D电子天平：温赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-250生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 木枣酵素工艺流程及操作要点

操作要点：

1) 预处理：将木枣清洗干净去核，置于干燥箱中调整温度为80 ℃，干燥3 h后用粉碎机粉碎并过筛。按1∶5（g/mL）的比例加入蒸馏水得到木枣汁。

2) 酶解：在处理后的木枣汁中加入果胶酶，果胶酶的用量2 mL/kg，然后放在电热恒温水浴锅中45 ℃酶解2 h。

3) 调配：取出手持糖度仪在室温条件下，先用蒸馏水调整刻度，在木枣果汁中少量多次地添加蔗糖，将糖度调整为20%。

4) 菌种活化：在锥形瓶中加入适量的活性干酵母，加入一些蒸馏水，放在提前预热好的水浴锅中水浴加热；配制MRS肉汤培养基，加入植物乳杆菌并在37 ℃条件下进行活化48 h。

5) 杀菌：将木枣果汁在70 ℃条件下保持30 min进行巴氏杀菌，最后冷却至室温。

6) 接种：将活化好的酵母菌、植物乳杆菌按试验的比例接入杀菌后的木枣果汁中，备用。

7) 发酵：调整接种的木枣果汁的温度和时间，静置发酵，得到木枣酵素，测定SOD酶活力的大小[6]。

1.2.2 SOD酶活力的测定

SOD酶活力的测定[7]：在25 ℃条件下在试管中加入0.2 mL稀释的样液，然后依次将2.5 mL浓度为0.1 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液（pH为8.2，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠）、2 mL蒸馏水、0.15 mL 4.5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后立即倒入石英比色皿中，在波长325 nm条件下分别测定初始时和1 min后的吸光度值，二者之差则为A1，空白比色皿用10 mmol/L盐酸调零，同样地用蒸馏水代替样液测定吸光度A0，SOD酶活性按式（1）计算。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 发酵时间的选择

固定糖度20%，加入植物乳杆菌4%，在38 ℃条件下，在不同发酵时间（1，2，3，4和5 d）发酵后，测定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[8]。

1.2.3.2 发酵温度的选择

固定糖度20%，加入植物乳杆菌4%，发酵2 d，在不同发酵温度（34，36，38，40和42 ℃）发酵后，测定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[9]。

1.2.3.3 菌种比例的选择

固定糖度20%，在38 ℃条件下进行发酵2 d，在不同菌种比例（1∶3，2∶3，1∶1，3∶2和3∶1）发酵后，测定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[10]。

1.2.3.4 接种量的选择

固定糖度20%，在38 ℃条件下进行发酵2 d，在不同接种量（2%，4%，6%，8%和10%）发酵后，测定超氧化物歧化酶（SOD）活力的大小[11]。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验的结果，将发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）三个因素作为响应面试验的考察对象，以超氧化物歧化酶（SOD）活力为评价指标[12]，设计三因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验，探索木枣果蔬酵素发酵的最佳工艺参数。试验因素、水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对SOD酶活力的影响

由图1可知，SOD酶活力随着发酵时间的变化而变化，刚开始酶活力明显上升，持续发酵到第2天时酶活力为277.89 U/mL，到达第3天的时候，酶活力明显下降，第4天比第3天稍有下降，其原因是发酵后期总酸不断上升，菌体处于衰亡期，消耗大量的营养物质，抑制了SOD酶的积累，导致酶活力呈下降的趋势，所以选择发酵时间是2 d较佳。

图1 发酵时间对超氧化物歧化酶活力的影响

2.1.2 发酵温度对SOD酶活力的影响

由图2可知，SOD酶活力随着温度的变化而变化，34～38 ℃ SOD酶活力明显上升，当温度达到38 ℃时，显示出SOD酶活力为277.47 U/mL，温度高于38 ℃或低于38 ℃时，不利于植物乳杆菌的生长，从而影响SOD酶活力的大小，所以选择发酵温度为38 ℃较佳。

图2 发酵温度对超氧化物歧化酶活力的影响

2.1.3 菌种比例对SOD酶活力的影响

由图3可知，当菌种比例为1∶3和2∶3时，SOD酶活力随着酵母菌比例的增大呈逐渐上升趋势，当菌种比例为2∶3时，SOD酶活力的最大值为275.81 U/mL。当菌种比例为3∶2和3∶1时，SOD酶活力随着植物乳杆菌比例的下降呈现缓慢下降的趋势，总体看来酶活力的大小变化比较平稳，所以不选菌种比例为响应面法试验的因素。

图3 菌种比例对超氧化物歧化酶活力的影响

2.1.4 接种量对SOD酶活力的影响

由图4可知，酶活力随着接种量的增大先逐渐升高，达到SOD酶活力最大值276.85 U/mL。继续增加接种量时，因为接种量太大，导致SOD酶活力稍有下降趋势，所以选择接种量为4%较佳。

图4 接种量对超氧化物歧化酶活力的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果

从单因素试验结果的分析中，选取发酵时间（A）、发酵温度（B）、植物乳杆菌接种量（C）为考察因素，根据响应面分析法中心组合设计原理进行响应面试验，木枣果素酵素发酵工艺优化的响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 回归模型的建立

对响应面试验结果应用Design Expert 7.0软件进行多元回归分析，得到SOD酶活力大小与发酵时间（A）、发酵温度（B）、植物乳杆菌接种量（C）的二次回归模型为：

式中，各项系数的绝对值的大小表示各影响因素对超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响大小，系数的正负表示该因素影响的方向，各因素对超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响由大到小依次为A＞C＞B。

根据表3可以看出，模型p=0.0001＜0.01，由此可以得出该模型具有极显著性，说明选取因素不同，超氧化物歧化酶（SOD）活力有显著差异；失拟项p=0.4086＞0.05，说明在试验选取的因素水平范围内，拟合程度较好，说明这个模型是可靠的，可用来分析和预测试验结果。从表3可以看出，在试验选取的这三个因素水平范围内，A、C影响极显著（p＜0.01），B影响显著（p＜0.05），二次项A2、B2对模型影响极显著，C2对模型影响显著。

表3 回归模型方差分析

2.2.3 响应曲面分析

根据响应曲面坡度的弯曲程度来体现SOD酶活力影响程度的大小。如果响应曲面相对平缓，说明其可容忍处理条件的影响[10]。等高线图的形状可以表示各变量之间的交互作用是否显著，椭圆状表明变量间的交互作用显著，圆形状表明交互作用不显著[11]。图5～图7反映出发酵时间、温度、接种量对超氧化物歧化酶（SOD）活力大小的影响。

图5 发酵时间和发酵温度交互作用的响应面与等高线

图6 发酵时间和接种量交互作用的响应面与等高线

图7 发酵温度和接种量交互作用的响应面与等高线

由图5可知，发酵时间和发酵温度对SOD酶活力的影响，呈现先上升后下降走势。从图6可以看出，在不断发酵的同时加入越来越多的菌，SOD酶活力先上升后下降呈现弧状。通过对图7研究可以看出，在发酵温度和接种量的不断增大的情况下，SOD酶活力同样出现先上升后下降的走向。由此可知，各因素之间交互作用的影响与单因素影响不一致，各因素间交互作用对响应值影响显著。

2.2.4 最佳提取条件验证

对制备工艺进行优化时运用Design-Expert 7.0软件，分析可得出发酵时间2 d、发酵温度38 ℃、接种量4%是木枣酵素发酵工艺的最佳条件，在这种情况下SOD酶活力大小为278.64 U/mL。并经过3次平行试验，得到的SOD酶活力为278.41 U/mL。因此，可以得出通过响应面优化得到的回归方程模型及最佳制备工艺是可靠的。

3 结论

试验通过采用木枣为原料，发酵菌种选用酵母菌和植物乳杆菌来制备木枣酵素。通过设计单因素试验，选取不同的发酵时间、发酵温度、接种量，测定酶活力得到各因素对超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响趋势图，在此基础上通过三因素三水平响应面优化试验设计，全面且直观地分析了各因素对SOD酶活力的影响，以及各因素之间的交互作用，建立回归模型，经过验证试验之后说明木枣果蔬酵素的模型非常靠谱，可得出影响SOD酶活力的主要因素是发酵时间和植物乳杆菌的接种量。木枣酵素发酵工艺优化的最佳条件为发酵时间2 d、发酵温度38 ℃、植物乳杆菌接种量4%。在此优化条件下，经验证试验，超氧化物歧化酶（SOD）活力为278.64 U/mL。此次试验得到的最佳工艺条件为木枣果蔬酵素发酵工艺的生产提供理论研究和科学依据，为酵素产业生产应用提供有效利用和参考价值。