鸽性别早期经济快速鉴定方法的研究

刘国乾，龙航宇，朱健润，李 淦，黄泳欣，黄建豪，陈益填,2，刘思伽*

（1.广东科贸职业学院，广东广州 510640；2.广东家禽科学研究所，广东广州 510430；3.华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642）

中国养鸽业发展迅猛，据中国畜牧业协会统计，2019 年存笼肉种鸽达4 500 万对，年出笼乳鸽7.5 亿只，但由于科研力量投入不足以及鸽子特有的生物学特性，肉鸽养殖技术落后于其他家禽，其中种鸽生产上的性别鉴别难题仍待解决。鸽性别难以辨别主要是由于鸽子是晚成鸟，出生雏不能像一般家禽（鸡、鸭及鹅等）通过翻肛方式进行性别鉴定，只能配对上笼时通过体型外貌及行为特征鉴别公母，但准确率不高。鸽子是典型的“一夫一妻”制，出现非雌雄配时，彼此打架，影响鸽舍安宁、产蛋及受精。目前，国内外学者在幼雏鸽性别鉴定方面的应用研究不多，主要是通过外貌行为特征、腹腔镜检、粪便类固醇检测及核型等方法进行鸽性别鉴定[2]，但这些方法准确率不高，鉴定过程繁琐，难以在生产上大规模推广。随着分子生物学发展，利用分子手段对幼雏鸽进行性别鉴定，具有准确性高、操作简便、成本低、对动物伤害较小等优点[1-2]。已报道的鸽性别分子鉴定方法主要集中在性染色体特异性片段CHD1[3]与EE0.6[4]，准确率能达100%，但已报道方法大多需繁琐的鸽基因组抽提步骤，还需琼脂糖凝胶电泳胶分析结果，很难在生产上推广应用。张莉等[5]对基因组抽提进行改进，采用羽毛和血液样本，不提取雏鸽基因组DNA，直接利用引物扩增CHD1基因的特异性片段，检测成本和复杂性大幅度降低，试验准确性也能达到100%，但仍需要核酸胶检测结果，易产生样品污染、假阳性及环境污染。

本研究在常规PCR 基础上，通过探索的裂解液简便获取鸽羽髓基因组DNA，利用双引物对同时扩增鸽性染色体W 上2 个特异性序列[6]，通过PCR 产物颜色判断公母，符合快速、准确及经济的检测要求，适合在规模化鸽生产及繁育上推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验样品采自于广东科贸职业学院养鸽基地，其中已知性别配对成功的雌雄个体30 对，28 日龄雏鸽20 只，每羽拔取翅膀或尾部带有毛囊的新生羽毛1～2 根，同时通过解剖观察性腺确定性别；生产验证样品采自于梅州市金绿鸽业有限公司，随机选择600 羽18～21 日龄雏鸽（性别未知的健康鸽），每羽拔取翅膀或尾部带有毛囊的新生羽毛1～2 根，放入含有100 μL裂解液的离心管中，室温保存，用于鉴别其性别。

1.2 幼雏鸽羽毛基因组DNA 获取 使用I（碱裂解法）、II（蛋白酶裂解法）和III（基因组试剂盒）3 种方法裂解新生羽毛羽髓，获得幼雏鸽基因组，I（碱裂解法）为取每羽鸽的1～2 根带毛囊的新生羽毛，通过EP 管盖挤出毛囊中羽髓；加入100 μL 裂解液A（组分为0.2 mol/L NaOH、0.5% Triton X-100、1% Tween-20 和0.15 mol/L NaCl），常温隔夜放置或60℃烘箱30 min，加入400 μL 溶液B（组分为50 mmol/L Tris、0.1% Tween-20和0.05 mol/L HCl），吸取1～2 μL 加入到PCR 反应液中，进行后续PCR 扩增；方法II（蛋白酶裂解法），是用蛋白酶K（RT403，天根生化科技（北京）有限公司）按说明书使用，37℃消化3 h，99℃加热15 min 以消除蛋白酶活性，获得鸽基因组DNA；方法III（基因组试剂盒）是用血液/ 细胞/ 组织基因组DNA 提取试剂盒（DP304，天根生化科技（北京）有限公司），按说明书步骤抽提基因组。

1.3 DNA 的浓度测定和质量检测 幼雏鸽基因组获取后，使用NanoDrop One 微量核酸蛋白浓度测定仪测定其浓度，同时采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA。

1.4 引物设计与合成 选择鸽W 染色体上特有的EE0.6与已报道未命名片段（命名为noval）2 个序列片段双引物进行扩增，引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 PCR 扩增 PCR 反应体系20 μL：2×mix 10 μL（诺唯赞），上、下游引物0.25 μL（双引物中每条引物也是0.25 μL，引物浓度为20 µmol/L），模板1 μL，补水到20 μL。PCR 反应程序：37℃，2 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃ 保存；直接加染料显色或者取10 μL PCR 扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 PCR 产物快速检测方法 探索Goldview、绿如蓝、EB 等核酸染料检测DNA 的灵敏度，做法为鸽基因组DNA 2 倍的倍比稀释3 份，稀释到第6 管，每管10 μL，然后分别加入上述核酸染料。

验证获取的基因组DNA 对显色结果影响，做法为吸取2 μL 所制备的1 根副翼羽新生羽髓、2 根副翼羽新生羽髓、3 根副翼羽新生羽髓及1 根主翼羽新生羽髓基因组DNA，加入到18 μL 反应液，而后加入2 μL 核酸染料EB（2000 稀释）紫外显色。

验证基因组模板对检测结果影响，做法为分别以公母 鸽90、45、9、1.8、0.36、0.072、0.014 ng 基因组量为模板，20 μL 反应体系进行PCR，核酸扩增结束后直接将2 μL 核酸染料EB（10 µg/mL）加入到PCR 产物中，然后在紫外下观察结果。

1.7 解剖观察性腺 未知性别的20 羽28 日龄幼鸽经过上述PCR 鉴定后，安乐处死解剖，观察其有无性腺睾丸确认公母，然后将性腺睾丸观察结果与PCR 性别鉴定结果作符合率比较，判定其准确性。

1.8 鸽场幼雏鸽验证统计 在种鸽留种试验时，鸽场随机选取600 羽准备留作种用幼鸽羽毛毛囊，用建立的方法进行雏鸽性别的快速鉴定，将雄鸽戴偶数脚环，雌鸽戴奇数脚环，配对生产后统计准确性。

2 结果与分析

2.1 鸽性别鉴定引物特异性验证 选择鸽W 染色体2 条特异性片段EE0.6 与片段noval，模板量约为50 ng，进行常规PCR，琼脂糖核酸凝胶结果（图1）显示，单引物noval 母鸽（NF 样品）扩增片段大小为450 bp 左右，公鸽（NM）无条带；单引物EE0.6 母鸽（EF）大小约360 bp，同样公鸽（EM）无条带；混合双引物noval与EE0.6 母鸽（NEF）有2 条大小与各自单引物大小一致的条带，公鸽（NEM）无条带。结果表明，无论是单引物还是混合引物都能特异性扩增出母鸽2 条特异性片段，在实践生产检测中为了避免假阴性，本研究选择混合双引物进行雏鸽性别鉴定。

图1 鸽引物特异性PCR 结果

2.2 灵敏度试验结果 将抽提的公母鸽基因组DNA 倍比稀释，进行双引物PCR 扩增，结果显示（图2），20 μL 反应体系中能够检测到0.36 ng 模板量，母鸽有条带，公鸽无条带，特异性好。

图2 检测灵敏度结果

2.3 幼雏鸽羽髓基因组快速获取 使用I、II 和III 3种方法直接裂解鸽新生羽毛羽髓，获得幼雏鸽基因组DNA，取5 μL 上样跑琼脂糖核酸电泳胶（图3-A），同时加1 μL 作为模板，20 μL 体系PCR 扩增（图3-B），结果显示I、II 和III 3 种方法均能直接获得幼雏鸽基因组，其中方法I 为碱裂解法，常温隔夜或者60℃烘箱放置30 min，获取的基因组DNA 在核酸胶最上方，基本没有断裂，基因组较完整；方法II 为蛋白酶裂解法，需加热水浴且耗时长，后期需要高温失活蛋白酶；方法III 为试剂盒抽提，价格较贵且耗时耗力。从简便、价格、稳定及生产实际情况等因素考虑，本研究选择I 方法获取幼雏鸽基因组DNA。

图3 幼雏鸽羽髓基因组快速获取

随后，检测I 方法裂解不同羽髓获得的基因组DNA 量，结果显示（表2），羽毛羽髓数量增加和羽髓大小决定获得的基因组DNA 量，羽髓数量越多、羽髓越大，获取基因组DNA 量越多，结合本研究PCR 灵敏度及后续结果染色，选择采集1～2 根副翼羽新生羽髓获取鸽基因组DNA。

表2 不同羽髓数裂解羽髓量（n=4） ng/μL

2.4 PCR 产物快速检测 先探索Goldview、绿如蓝、EB 等核酸染料检测DNA 的灵敏度，结果显示（图4），3 种核酸染料检测灵敏度Goldview 为68 ng/μL，绿如蓝为68 ng/μL，EB 为34 ng/μL，核酸染料EB 灵敏度高于其他2 个，从灵敏度、价格及配套仪器等综合因素考虑，本研究选择核酸染料EB 显色PCR 产物。

图4 不同核酸染料灵敏度检测结果

再验证获取的基因组DNA 对显色结果影响，结果表明（图5），1～2 根羽髓获得的基因组不影响显色结果，高于2 根或者使用大的主翼羽或者尾羽对显示可能有干扰。

图5 羽髓基因组DNA 对显色影响

然后直接检测PCR 产物，验证基因组模板对检测结果影响，在紫外下观察结果（图6），公母鸽直接荧光显色结果与核酸电泳结果一致，表明核酸染料EB 能够直接用于PCR 产物快速检测。

图6 PCR 产物快速检测结果

2.5 性别未知的乳鸽PCR 扩增结果分析 使用混合双引物，对编号为1～18 的18 只未知公母的28 日龄幼鸽进行性别鉴定，显示母鸽 12 只，公鸽6 只（图7、8），然后分别进行解剖，通过观察性腺加以确认，以雄性个体的性腺1 对白色睾丸（图9）为判定标准，与核酸染料显色结果一致（图9），与核酸电泳胶鉴定结果一致（表3），显示此PCR 方法准确率100%，同时简洁、高效。

图7 未知公母的28 日龄乳鸽性别鉴定核酸电泳胶结果

图8 未知公母的28 日龄乳鸽性别鉴定染色紫外照射结果

图9 28 日龄乳鸽解剖睾丸图示

表3 鉴定结果统计

2.6 早期性别鉴定方法生产上经济快速准确 在金绿鸽业生产场，利用本试验建立的快速性别鉴定法鉴定了600 羽，母鸽有292 羽，公鸽有308 羽，配对生产后证明其准确率为99.7% 。

生产上，将性别鉴定方法进一步简化，将100 μL 裂解液A 加入到1.5 mL EP 管，采集1～2 根乳鸽新生羽髓放入管中，室温放置过夜，然后加入中和液B，吸取1～2 μL加入到PCR 反应液，PCR 扩增后直接加入2 μL 核酸染料EB 紫外显色，分辨公母，步骤流程如下（图10）。

图10 性别检测步骤

检测成本约0.8 元一个样品，其中基因组DNA 裂解液约0.02 元，PCR 反应液及引物约0.6 元，其他试剂耗材约0.18 元，与已有检测方法相比[8-9]，成本大大降低。

3 讨 论

3.1 幼雏鸽羽髓基因组DNA 获取 吕夕超等[7]提取鸽基因组DNA，通过PCR 扩增鸽CHD1基因的特异性序列，能够100%准确鉴定信鸽性别。孙嘉等[8]使用传统方法提取鸡血液、羽毛等基因组DNA，也可准确快速鉴定鸡和鸡胚的性别；其他研究者[9-12]使用基因组抽提方法获取DNA 模板，也能准确鉴定鸟类性别，但这些研究采用基因组抽提获得DNA 模板，工作繁琐且成本高，使其很难在生产上推广。本研究采用裂解液A 常温裂解幼雏鸽毛囊，然后加入中和液B，直接吸取1 μL进行PCR，常温裂解保存效果好，利于鸽场采样到实验室运输，简洁快速经济。

3.2 假阳性假阴性防止 通过鸟类性染色体ZW 上特异性基因片段差异鉴定鸟类性别，准确高效，已有研究常采用CHD1基因[3,13]与EE0.6 特异性片段[14]鉴定鸟类性别。Hu 等[15]证明采用CHD1基因，跨过其内含子设计引物进行PCR 扩增，雌性可以扩增出2 条带，雄性只能扩增出1 条带，可以准确鉴定非平胸鸟类的性别；孙洪霞等[16]证明采用EE0.6 与CHD1 片段特异性引物能够对石岐鸽进行性别鉴定；孙志明等[4]证明采用CHD1 和EE0.6 特异性引物可准确对白枕鹤、丹顶鹤进行性别鉴定。上述方法均采用常规PCR 扩增，且为单基因单引物PCR 扩增，理论上准确率100%，但会出现假阴性以及气溶胶污染[17]。本研究采用双基因混合引物扩增，雌鸽2 条带，雄鸽无条带，可以降低假阴性，且采用UDG/dUTP 防污染体系，能够防止气溶胶等污染，避免假阳性。

3.3 准确性及结果显色 本研究方法在实验室多次验证准确性均为100%，而在生产群上检测600 只乳鸽，准确性为99.7%，分析原因可能是加样错加漏加等导致。常规PCR 扩增结果，目前是通过琼脂糖核酸电泳胶法分析，还没有指示剂直接显色PCR 结果的报道。本研究应用常用的双链DNA 染色剂EB 显色常规PCR 产物，结果表明采用本研究探索的鸽基因组DNA 获取方法，EB 染料能够应用于常规PCR 产物检测，解决了常规PCR 结果快速简便读取难题。

4 结 论

本研究建立了一种快速、经济的鉴定幼雏鸽性别的分子方法，在幼雏鸽基因组DNA 获取、假阳性假阴性控制及结果分析等方面具有创新性。所建立的鉴定雏鸽雌雄方法，快速、准确、简便，大大缩短了鉴别时间，降低了鉴定成本，不仅为养鸽场提供科学的性别鉴定方法，也为基因快速经济检测提供一种新途径。