依维莫司干预肾癌细胞时解偶联蛋白2对能量代谢的影响及意义

罗浩鸣，谷江，张永春，沈亚楠

贵州医科大学附属医院泌尿外科，贵阳550004

依维莫司作为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂之一，目前广泛应用于晚期肾癌治疗，主要机制包括干扰细胞周期、血管新生、糖酵解等相关蛋白的翻译和合成［1］。然而，依维莫司在临床上的治疗效果并不让人满意，P13K-Akt-mTOR 通路的再次激活可能是导致治疗失败的关键因素。P13K-Akt-mTOR 是癌症发生和发展的主要信号通路，通过调控能量代谢相关蛋白表达及糖酵解关键酶类活性，满足肿瘤细胞恶性增殖的需要［2］。UCP-2作为线粒体内膜上的转运蛋白，具有介导质子漏、调节细胞内氧化水平、影响线粒体膜电位等功能［3］。BAFFY 等［4］发 现 ，UCP-2 高 表 达 使 三 磷 酸 腺 苷（ATP）的主要来源从细胞内线粒体氧化磷酸化转变为胞质有氧糖酵解。最新研究显示，mTOR 抑制剂通过与线粒体直接相互作用改变线粒体载体蛋白的基因表达从而影响线粒体功能，并且该研究还发现mTOR 抑制剂的使用增加了UCP-2 表达，使P13KAkt-mTOR 通路再次磷酸化，诱导肿瘤自噬和产生抵抗。UCP-2 可能是依维莫司治疗效果差的关键。2020 年4 月—10 月，本研究观察了依维莫司靶向抑制肾癌细胞时UCP2 的表达变化对癌细胞增殖及凋亡的影响，从线粒体产能结构角度分析UCP2 表达上调后对细胞能量代谢的调控及糖酵解关键酶活性的影响，为肾癌靶向治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 肾癌细胞（GRC-1）购自上海弗雷堡生物公司，依维莫司购自北极博奥森公司（4 ℃避光保存），DMEM/F-12 和MTT 试剂盒购自贵阳凯信生物有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，细胞凋亡试剂盒、TRlzol 裂解液、HiScript Ⅱ Q Selcet RT SuperMix for qPCR 和ChamQTM Universal SYBR QPCR Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，人ATP、M2-型丙酮酸激酶（PKM2）、异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）酶联免疫吸附测定试剂盒购自苏州科铭生物有限公司。细胞培养箱购自美国ThermoFisher公司，全波长酶标仪美国Bio Tek，流式细胞仪购自美国BDBiosciences 公司，实时荧光定量PCR 仪购自德国Analytik Jena 公司，DU800 紫外分光光度计/核酸蛋白分析仪购自美国Beckman Counter 公司，离心机购自德国Eppendorf 公司，电泳仪购自德国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养 复苏GRC-1 细胞后并将其置于培养基中，在37 ℃、含5% CO2培养箱中培养24～28 h，根据细胞生长状态，更换培养基。待细胞铺满至80%～90%时，进行细胞传代。

1.3 细胞增殖活性检测 采用MTT 法。依维莫司配制：5 mg 依维莫司加入261µL DMSO 溶解配制为20 mmol/L 依维莫司储存液保存备用。根据C1V1=C2V2计算所需稀释液体积，加入DMSO 进行稀释，将药物浓度分别调整为0、5、10、20、40 µmol/L，进行半数抑制浓度实验。收集对数生长期细胞，细胞重悬后进行计数，将细胞调整为1×105/mL，96 孔板每孔加入100µL细胞，保证细胞量为5 000个/孔，96孔板边缘加入磷酸缓冲盐溶液填充防止培养基挥发。细胞在培养箱培养12 h（5%CO2，37 ℃），加入不同浓度的依维莫司干预，放回培养箱继续培养72 h。提前4 h 加入 10 µL/孔 MTT 溶液，培养箱避光孵育（5%CO2，37 ℃）。孵育完成后取出，移除培养基，96孔板中每孔加入100µL Formanzan 溶解液，振荡10 min，酶标仪测定570 nm 吸光度。根据吸光度值软件计算依维莫司干预GRC-1 肾癌细胞的半数抑制浓度（IC50），然后根据依维莫司的不同干预浓度将肾癌细胞分为对照组（干预浓度为0）、初始浓度组（干预浓度为1/8 IC50）、低浓度组（干预浓度为1/4 IC50）、中浓度组（干预浓度为1/2 IC50）、高浓度组（干预浓度为IC50）。分组完成后按上述操作步骤调整依维莫司干预浓度及培养时间再次进行培养，完成后收集数据，根据下列公式计算抑制率，抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡检测 细胞处理及分组同1.3，干预72 h 后，用去离子水将 10×Binding Buffer 稀释成 1×Binding Buffer。胰酶消化收集后，离心，收集细胞。用预冷1×PBS 重悬细胞1 次，离心，洗涤细胞。加入100 µL 的 1×Binding Buffer 悬浮细胞。加入 5 µL 的Annexin V-FITC 混匀后，避光、室温孵育15 min。上机前5 min再加入5µL的PI染色、200µL的1×Bind-ing Buffer，使用流式细胞仪进行检测。计算细胞凋亡率。

1.5 细胞中UCP2 mRNA表达检测 采用RT-PCR。细胞处理及分组同1.3，干预72 h后，收集细胞，加入1 mL TRIzol 混匀，静置，加入200 µL 氯仿，颠倒摇晃15 s，静置2～3 min，离心，取上层，放置于1.5 mL Eppendorf 管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置，离心，底部可见棉絮状沉淀，即为RNA 沉淀。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，用移液枪反复吹打洗涤RNA沉淀，离心，弃上清，加入20µL无RNase水溶解RNA 沉淀，用移液枪反复吹打帮助溶解。取1 µL RNA 溶解液，以去离子水作对照，测OD260值及RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，反应条件：55 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。反应结束后以cDNA为模板进行PCR扩增。反应条件：95 ℃3 min 预变性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35 个循环。UCP2 引物序列：5'-CCCAATGTTGCTCGTAATG-3'，5'-CCCAAAGGCAGAAGTGAAG-3'。 β -actin 引 物 序 列 ：5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，5'-CGTGATCTCCTTCTGCATCCTG-3'。以β-actin作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.6 细胞中PKM2、IDH1活性检测 细胞处理及分组同1.3，干预72 h后，收集细胞，离心，取上清，低温保存备用。设置标准品孔、样本孔。标准品ATP 浓度分别为6 400、3 200、1 600、800、400、200 nmol/L，PKM2分别为4 000、2 000、1 000、500、250、125 pg/mL，IDH1 分别为3 200、1 600、800、400、200、100 pg/mL。标准品孔中加不同浓度的标准品50 µL，样本孔中加入待测样本50µL。加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 µL，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱孵育1 h。孵育完成后拿出反应板，弃液，吸水纸上拍干，每孔加满1×洗涤液400 µL，静置1 min，甩去洗涤液，再次吸水纸上拍干，反复5次。清洗完成，每孔加入底物A、B各50µL，室温下避光孵育15 min。孵育结束，每孔加入终止液50µL，450 nm 波长处测定各孔OD 值。根据标准品OD 值和浓度绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.7 细胞中ATP 水平检测 细胞处理及分组同1.3，干预72 h 后，离心，分别加入无血清培养基500µL、2%三氯醋酸500µL，冰浴，再次离心5 min，取200 µL 上清液、NADH 液200 µL 与磷酸甘油醛脱氢酶-磷酸甘油激酶20µL混合，记录NADH下降A值，按照标准曲线计算ATP水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 依维莫司对GRC-1细胞的IC50为29.60µmol/L。对照组、初始浓度组、低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞增殖抑制率分别为0、（15.93 ± 6.38）%、（24.73 ± 3.10）%、（45.79 ±6.00）%、（49.84± 6.29）%，除中、高浓度组外，各组两两比较P均＜0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组、初始浓度组、低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞凋亡率分别为（7.41 ± 1.08）% 、（15.71 ± 3.24）% 、（30.18 ±3.59）%、（58.18 ± 6.38）%、（48.63 ± 0.88）%，两两比较P均＜0.05。

2.3 各组细胞中UCP2 mRNA 表达比较 对照组、初始浓度组、低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞中UCP2 mRNA 相对表达量分别为1.00 ± 0.10、1.26 ± 0.06、1.41 ± 0.14、1.88 ± 0.07、2.32 ±0.02，中浓度组、高浓度组与各组比较P均＜0.05。

2.4 各组细胞中PKM2、IDH1活性比较 见表1。

表1 各组细胞中PKM2、IDH1活性比较（ng/mL，）

表1 各组细胞中PKM2、IDH1活性比较（ng/mL，）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与初始浓度组相比，bP＜0.05；与低浓度组相比，cP＜0.05；与中浓度组相比，dP＜0.05。

IDH1组别PKM2 1.11±0.06 1.11±0.01 0.88±0.07ab 0.86±0.15ab 0.66±0.02abcd对照组初始浓度组低浓度组中浓度组高浓度组1.41±0.06 1.10±0.04a 0.98±0.03ab 1.12±0.02abc 1.26±0.03abcd

2.5 各组细胞中ATP 水平比较 对照组、初始浓度组、低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞中ATP 水平分别为（1.93 ± 0.14）、（1.79 ± 0.07）、（1.67 ±0.09）、（1.41 ± 0.02）、（1.57 ± 0.08）µmol/L，低浓度组、中浓度组、高浓度组与对照组相比，中浓度组、高浓度组与初始浓度组相比，中浓度组与低浓度组、高浓度组相比，P均＜0.05。

3 讨论

肿瘤治疗效果的减退与肿瘤细胞的适应性机制有关，这种适应性机制与UCP2 关系密切。UCP2 位于线粒体内膜，属于线粒体转运蛋白家族［5］。在1997年研究相同的家族成员UCP1时偶然被发现［6］。UCP2 在人体的许多器官和组织中都有表达，如皮肤［7］、脑［8］、肝脏［9］和肾脏［10］。2018年 CADENAS［11］发现UCP2 能够降低氧化磷酸化效率，参与调控线粒体活性氧（ROS）的产生。肿瘤细胞在不利于生存的环境下，会产生大量的ROS 导致氧化应激损伤，诱导细胞凋亡，降低增殖效应［12］。UCP2通过增加自身的表达抑制细胞中ROS 的产生，使细胞避免氧化应激造成的损伤。由于UCP2 具有调控ROS 的作用，因此也参与了肿瘤细胞的适应性机制［13］。此外，UCP2的表达还可影响肿瘤代谢及耐药性等方面［14］。实际上，LIM 等［15］发现UCP2在肾癌中的表达并未增加。推测在靶向治疗肾癌的过程中治疗效果的减退、耐药性的产生与UCP2的表达上调有关。

本研究结果显示，随着药物浓度的增加，肾癌细胞中UCP2 mRNA 表达增加。依维莫司对肾癌细胞的生长抑制随着浓度增加而增强，但在中、高浓度组依维莫司对肾癌细胞的增殖抑制率并无明显差异。凋亡实验发现中浓度组肾癌细胞凋亡率达到最高，但依维莫司浓度进一步增加后，高浓度组细胞凋亡率下降，结合UCP2 表达的上升，提示依维莫司在干预肾癌细胞时的UCP2 表达增加可能减弱了依维莫司对肾癌细胞的抑制效应，这与相关研究证实的UCP2 过表达影响肿瘤细胞的增殖及凋亡的结果一致［16］。有关UCP2 在肿瘤中的研究目前尚少，相关研究表明，在具有药物耐药性的肿瘤细胞中存在UCP2 过表达，这提示UCP2 可能是使肿瘤产生凋亡抗性及促进其发生发展的关键［17］，具体机制仍在研究当中。

学者们认为肿瘤适应性机制与Warburg 效应在肿瘤细胞中活跃程度有关。Warburg 效应指肿瘤细胞依赖的供能主要由高度活跃的糖酵解支持，它是肿瘤为了适应组织内部低氧以及缺血缺营养的不利条件而发生的一种适应性改变［18-19］。线粒体作为ATP产生的主要场所，参与细胞发展、分化和能量代谢的过程［20］。线粒体的缺陷和突变与癌症的发生和发展密切相关［21］，UCP2表达增加是肿瘤细胞中线粒体发生突变的常见结果［22］。相关研究发现，UCP2过表达对线粒体具有一定保护作用，直接影响ATP 的合成［23］。mOTR作为Warburg效应的中央激活剂［24］，由两种多蛋白复合物mTORC1 和mTORC2 组成，mTORC1 是依维莫司主要的抑制靶点，而mTORC2对依维莫司并不敏感。抑制mTORC1 会阻断P13KAkt-mTOR 通路的信号传递，从而对肿瘤细胞的增殖及能量代谢产生抑制效应，但是也破坏了P13KAkt-mTOR 通路的负反馈机制，导致该条通路上其他靶点异常激活，引起多种细胞级联反应，可能导致相关耐药性的产生，限制依维莫司的治疗效果。最新的研究已经证实mTOR 抑制剂的使用，可以刺激UCP-2 表达，而UCP-2 表达上调与肿瘤细胞中能量代谢关系密切［25］。综上，mTOR 抑制剂治疗效果的减低与癌细胞耐药性的产生可能与UCP2 表达上调后刺激肾癌细胞中Warburg效应密切相关。

虽然，Warburg 效应是肿瘤的特征之一，但肿瘤细胞的能量代谢方式仍需要氧化磷酸化的参与，两条途径共同为肿瘤细胞提供ATP。而两条途径对于ATP 的贡献具有明显差异，这种差异赋予肿瘤细胞不同于正常细胞快速增殖的特点，而糖酵解可能是维持这种特点的关键［26］。并且，糖酵解途径生成的必需代谢中间体，可以满足快速增殖过程中大分子生物合成需求。国外学者BHASKAR 等［27］认为糖酵解不仅可以促进肿瘤发展，还可以为肿瘤提供一种复杂的缺氧环境，增加肿瘤的耐药性。丙酮酸激酶是催化糖酵解途径中最后一步生成丙酮酸及ATP的关键酶，其活性的变化直接影响糖酵解途径。目前研究较多为PKM2 型，该型以单体、二聚体、四聚体形式存在。四聚体以其中活性最高的形式存在，是由糖酵解一阶段产物1，6-二磷酸果糖的异构激活形成。由于磷酸烯醇式丙酮酸与二聚体聚合后的米氏常数高于PKM2 的四聚体形式，所以PKM2 二聚体酶活性较低。PKM2 的单体形式主要参与细胞周期的调节及 Warburg 效应［28］。SUN 等［29］发现，PKM2是哺乳动物mTOR 下游的重要靶标，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 可刺激PKM2 表达，增强Warburg效应。哺乳动物mTOR 可通过HIF-1 介导的PKM 基因转录与c-myc 所介导的选择性切割进一步增加PKM2 的表达，促进癌症的进展［30］。异柠檬酸脱氢酶（IDH）是三羧酸循环中重要限速酶，其活性改变会阻碍三羧酸循环的正常运转。IDH1 活性与肿瘤早期的形成有关，IDH1活性增加可以抑制肿瘤早期恶性转化与形成。而IDH1 活性降低与抑制线粒体呼吸相关，通过影响细胞的正常能量代谢，抑制线粒体呼吸［31］。因此，IDH1可能参与了肿瘤多种生理活动。本实验将这两种酶类活性作为观察两条途径状态变化的对象。实验中，中浓度组PKM2 活性开始上升，同样的，UCP2表达也出现增加，但ATP仍处于较低水平，可能是此时肿瘤细胞中ATP 主要依靠氧化磷酸化产能供给。随着依维莫司浓度的进一步增加，UCP2 表达及 PKM2 活性上升，ATP 水平也出现一定程度的恢复，可能此时ATP 的主要来源已转变为糖酵解。以往的研究发现，丙酮酸激酶活性受细胞内氧化应激水平的负向调节［32］，而UCP-2通过解耦联作用减少ROS的产生，并且发挥载体的功能，将丙酮酸运至线粒体基质参与糖酵解。因此，UCP-2可能通过调控细胞内ROS 间接刺激了丙酮酸激酶活性，使糖酵解加强。从实验结果来看，除高浓度组外，其余浓度组IDH1活性变化较小，说明氧化磷酸化途径对ATP贡献的比重维持在一个相对恒定的状态。

UCP-2 通过三羧酸循环负性调控乙酰辅酶A 生成底物的氧化，从而降低线粒体呼吸链上的氧化还原压力，达到保护肿瘤细胞的作用。细胞线粒体内膜电位也可能是促使UCP2 表达的相关因素。国外研究发现，mTOR 抑制剂的使用会使线粒体膜电位超极化，影响线粒体ATP 的正常产生［33］。由于受到线粒体膜电位变化的刺激，为了保证自身恶性增殖时的能量获取，肿瘤细胞中线粒体内膜上UCP2 的表达开始增加，糖酵解途径逐渐活跃，导致线粒体ATP 合成加快，提示UCP-2 对线粒体具有一定保护作用。结合本实验结果，依维莫司在一定浓度时对肿瘤细胞增殖及能量代谢均有明显抑制作用，而当浓度增加时，UCP2 及ATP 水平开始恢复并出现上升，糖酵解途径活跃，细胞凋亡减慢，说明UCP2 可能是通过刺激PKM2 的活性，导致糖酵解途径活跃从而影响了依维莫司对肿瘤细胞抑制效应。

目前，对于晚期肾癌患者来说，靶向治疗是提高总生存率和提升生活质量的关键，但治疗效果并未达到预期，治疗过程中，耐药性的出现、二次复发转移、后期治疗效果减退等都是仍需克服的难题。