丹参饮介导过氧化物酶体增殖物激活型受体γ减轻大鼠冠脉粥样硬化

祝雪丽 熊尚全 陈怀宇 褚剑锋 吴翔 何绍吾 李玮

摘要 目的：研究丹參饮通过介导过氧化物酶体增殖物激活型受体γ（PPAR-γ）/肝X受体α（LXR-α）/三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）信号通路减轻大鼠冠状动脉粥样硬化的作用机制。方法：选取无特定病原体（SPF）级40只健康Wistar大鼠作为实验动物，随机分为空白组、冠状动脉粥样硬化组（对照组）、丹参饮低剂量观察组（低剂量组）和丹参饮高剂量观察组（高剂量组），比较各组大鼠的炎症介质水平、ICAM-1水平、脂代谢水平、PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表达和蛋白表达。结果：对照组、低剂量组和高剂量组的三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均高于空白组（P<0.05），低剂量组和高剂量组的TG、TC和LDL-C均低于对照组（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组（P<0.05），但4组的HDL-C表达差异无统计学意义（P>0.05）;对照组、低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均高于空白组（P<0.05），低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均低于对照组（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组（P<0.05）;对照组、低剂量组和高剂量组的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表达均高于空白组（P<0.05），且低剂量组和高剂量组明显高于对照组（P<0.05），高剂量组明显高于低剂量组（P<0.05）。结论：丹参饮可以通过对PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信号通路的介导，发挥出抗冠状动脉粥样硬化的作用。

关键词 丹参饮;冠状动脉粥样硬化;过氧化物酶体增殖物激活型受体γ;肝X受体α;三磷酸腺苷结合盒转运体A1;丹参;檀香;砂仁;冠心病预防

Abstract Objective：To study on Danshen Drink by mediating peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPAR-γ）/liver X receptor α（LXR-α）/adenosine triphosphate binding cassette transporter A1（ABCA1） signaling pathway to alleviate the mechanism of coronary atherosclerosis of rats.Methods：A total of 40 healthy Wistar rats of SPF-free grade were selected as the experimental animals，and were randomly divided into a blank group，a coronary atherosclerosis group（control group），Danshen Drink low-dose treatment group（low-dose group） and Danshen Drink high Dose treatment group（high-dose group）.The levels of inflammatory mediators，ICAM-1，lipid metabolism，PPAR-γ，LXR-α and ABCA1 mRNA expression and protein expression in each group of rats were compared.Results：The triacylglycerol（TG），cholesterol（TC），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C） of the control group，low-dose group and high-dose group were all higher than those of the blank group（P<0.05），the TG，TC and LDL-C of the low-dose group and the high-dose group were lower than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was lower than the low-dose group（P<0.05），but there was no statistically significant difference in the HDL-C expression of 4 groups（P>0.05）; the expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group，low-dose group and high-dose group were higher than those in the blank group（P<0.05），low-dose group and high-dose group The expressions of inflammatory mediators and ICAM-1 in the control group were lower than those in the control group（P<0.05）.The protein expressions of PPAR-γ、LXR-α and ABCA1 mRNA were higher than those of the blank group（P<0.05）.And the low-dose and high-dose groups were significantly higher than those of the control group（P<0.05），and the high-dose group was significantly higher than the low-dose group（P<0.05）.Conclusion：Danshen Drink can play an anti-coronary atherosclerosis effect by mediating the PPAR-γ-LXR-α-ABCA1 signaling pathway.

Keywords Danshen Drink; Coronary atherosclerosis; PPAR-γ; ABCA1; LXR-α; Radix Salviae Miltiorrhizae; Lignum Santali Albi; Fructus Amomi Villosi; Prevention of coronary heart disease

中图分类号：R289.5;R541.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.010

冠状动脉是动脉粥样硬化的主要累及血管，冠状动脉粥样硬化会导致患者出现管腔闭塞或破裂、出血，增加了患者的心血管疾病发生率，威胁到了患者的身体健康[1-3]。近年来，相关临床研究发现过氧化物酶体增殖物激活型受体γ（PPAR-γ）/肝X受体α（LXR-α）/三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）信号通路与机体的动脉粥样硬化密切相关[4]。其中PPAR-γ的活化可以减少机体内趋化因子受体的表达，从而减少了斑块周围产生的炎症反应，发挥出了对动脉粥样硬化的预防作用[5-6]。基于此，本研究丹参饮通过介导PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信号通路减轻大鼠冠状动脉粥样硬化的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

本研究于上海斯莱克实验动物有限公司内购进了40只无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级健康Wistar大鼠，雌雄各半，体质量为250～310 g，平均体质量为（283.55±34.48）g。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005;实验动物使用许可证SYXK（闽）：2016-0005。动物实验中心环境卫生清洁符合标准，实验动物按照要求进行喂食，控制温度（24±2）℃，湿度控制在50%左右。

1.1.2 药物

丹参饮（丹参30 g、檀香4.5 g、砂仁4.5 g），购进于福建中医药大学附属人民医院中药房，浸泡30 min后，按照W/V=1/8的比例加水煎煮2次（檀香后下），药液经1 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min后去除杂质，将其浓缩为含生药量1 g/mL。

1.1.3 试剂与仪器

试剂：PPAR-γ（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：SC-7273）;LXR-α（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：sc-377360）;ABCA1（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：sc-58219）;逆转录试剂盒（北京康为世纪生物有限公司，批号：c-23169）;羊抗鼠IgG（北京康为世纪生物有限公司，批号：c-33365）;羊抗兔IgG（北京康为世纪生物有限公司，批号：c-50243）;RIPA裂解液（北京康为世纪生物有限公司，货号：ps0013）;Trizon（北京康为世纪生物有限公司，批号：39es50）;BCA試剂盒（北京康为世纪生物有限公司，批号：c-44123）。

仪器：小动物呼吸机（北京北瑞未来科技公司，型号：DW-3000B）;高速小型台式离心机（上海贝曼生物科技发展有限公司，型号：1-13型）;Realtime-PCR仪（ABI公司，美国，型号：7900型）;水平电泳槽（山东鑫贝西科学仪器有限公司，型号：DYCP-31DN型）;电泳仪（北京鼎国生物技术发展中心，型号：170-3920型）;电转仪及附件（伯乐BIO-RAD公司，美国，型号：170-3930型）;NC膜Whatman硝酸纤维素膜（上海柏丝特生物公司，型号：10401396）;滤纸（沃特曼Whatman公司，英国，型号：3MMCHR型）;高效液相色谱仪（杭州瑞析科技有限公司，型号：1260Ⅱ型）;微量加样枪（Eppendorf公司，德国，型号：3114）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

所有SD大鼠自由饲养7 d后，随机将其分为空白组、对照组和观察组，空白组10只喂饲普通饲料，对照组10只和观察组20只喂饲高脂饲料，每日高脂饲料（胆固醇：猪油：丙硫氧嘧啶：基础饲料=4∶10∶0.2∶86的比例配制）喂养，并灌胃脂肪乳剂10 mL/（kg·d），脂肪乳剂配制方法：将猪油20 g融化后，加入10 g胆固醇、2 g胆酸钠，搅匀后加入20 mL吐温，蒸馏水加至100 mL充分混匀，使用时使用37 ℃水浴融化，连续喂养6周。

1.2.2 给药方法

观察组及对照组在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D60万IU/kg，观察组分为低剂量组和高剂量组各10只。按大鼠与人的体质量及体表面积比值换算公式得到大鼠每天灌胃7.74 g/（kg·d），其中低剂量组在高脂饲料基础上添加浓缩液一半的剂量（计算量=0.5×7.74 g/（kg·d）×大鼠的体质量）灌胃治疗，1次/d，于中午喂食，高剂量组在高脂饲料基础上添加全部浓缩液的剂量（计算量=7.74 g/（kg·d）×大鼠的体质量）灌胃治疗，1次/d，于中午喂食。所有大鼠均饲养6周。

1.2.3 检测指标与方法

1）经大鼠尾静脉取空腹血液标本，使用全自动生化分析仪对大鼠的脂代谢指标进行检测，包括三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。2）采用脊柱脱臼法处死大鼠，在冰浴条件下纤维操作分离冠状动脉标本，采用PCR法和Western Blotting法检测大鼠的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、核因子κB和黏附因子（ICAM-1）的表达情况。3）采用荧光定量PCR法对大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表达水平进行检测，按照Tirzol试剂盒的相关操作说明提取总RNA，同时按照逆转录试剂盒的说明逆转录合成cDNA，并对其进行PCR扩增，于95 ℃的条件下预变性10 min，随后在95 ℃条件下15 s，60 ℃条件下60 s反复循环40次。4）采用Western Blotting法对大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表达进行检测，取大鼠主动脉血管，使用液氮研磨后将0.5 mL的RIPA裂解液加入，并进行逆超声破碎，离心取上清后采用BCA法对蛋白水平进行测定。引物序列见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对统计数据进行处理，多组间计量资料使用F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的脂代谢水平比较

对照组、低剂量组和高剂量组的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白组（P<0.05），低剂量组和高剂量组的TG、TC和LDL-C均低于对照组（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组（P<0.05），但各组的HDL-C表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 各组大鼠的炎症介质和ICAM-1表达比较

对照组、低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均高于空白组（P<0.05），低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均低于对照组（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组（P<0.05）。见表3。

2.3 各组大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表达比较

对照组、低剂量组和高剂量组的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA表达均高于空白组（P<0.05），且低剂量组和高剂量组明显高于对照组（P<0.05），高剂量组明显高于低剂量组（P<0.05）。见表4。

2.4 各组大鼠的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表达比较

对照组、低剂量组和高剂量组的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1蛋白表达均高于空白组（P<0.05），且低剂量组和高剂量组明显高于对照组（P<0.05），高剂量组明显高于低剂量组（P<0.05）。见表5。

3 讨论

动脉粥样硬化作为心脑血管疾病发生的主要病理基础，其与机体的血脂异常密切相关，合理的使用降脂药物对动脉粥样硬化的预防和治疗具有积极作用[7-9]。相关临床研究发现，PPAR-γ与LXR-α均属于和转录因子超家族成员，在机体的脂质代谢中发挥出了重要的作用，同时也是目前高血脂药物的治疗新靶点[10-14]。丹参作为一种传统中药，相关临床研究发现其具有较好的机体免疫调节作用，同时还具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等功效[15-17]。有报道指出，丹参中具有多种抗氧化活性成分，其与山楂等中药是目前临床中心血管疾病的常用预防和治疗药物，并发挥出了较好的疗效[18-19]。还有报道发现，丹参中的主要成分为丹参酮，而其可以通过对机体内环境的改善，发挥出舒张血管的功效，可以有效调节患者的血脂水平[20]。

本研究通过对各组大鼠脂代谢表达的比较，结果发现对照组、低剂量组和高剂量组的TG、TC、HDL-C和LDL-C均高于空白组，低剂量组和高剂量组的TG、TC和LDL-C均低于对照组（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组，但各組的HDL-C表达并无显著差异，表明高剂量的丹参饮可以有效降低冠状动脉粥样硬化大鼠的血脂表达。对照组、低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均高于空白组，低剂量组和高剂量组的炎症介质和ICAM-1表达均低于对照组，且高剂量组低于低剂量组，说明丹参饮有利于降低大鼠的炎症反应。同时，本研究发现对照组、低剂量组和高剂量组的PPAR-γ、LXR-α和ABCA1 mRNA和蛋白表达均高于空白组，且低剂量组和高剂量组明显高于对照组，高剂量组明显高于低剂量组，说明丹参饮可以通过对PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信号通路的介导，从而实现对冠状动脉粥样硬化的治疗，主要是因为丹参饮中的丹参具有活血化瘀的功效，药剂中的砂仁可以通过与檀香的配伍，发挥出活血行气、止痛通络的功效[21]。

综上所述，丹参饮作为一种传统的中药制剂，其可以通过对PPAR-γ-LXR-α-ABCA1信号通路的介导，发挥出抗冠状动脉粥样硬化的作用，应在临床广泛应用及推广。

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（2021-04-28收稿 责任编辑：张雄杰）