发育时期和植烟海拔对红花大金元烟花腺毛分泌成分的影响

解胜男 范志勇 付秋娟 韩晓 蒯雁 宗鹏 王德勋 杜咏梅

摘 要：烟草花序富含西柏三烯二醇（CBT-diols）、蔗糖酯（SE）等腺毛分泌成分。为明确发育时期和植烟海拔对烟花腺毛分泌成分的影响，本研究以云南大理红花大金元花序为研究材料，应用液相色谱仪、气质联用仪分别测定其烟花中的CBT-diols、SE，研究了CBT-diols、SE积累量随发育时期及植烟海拔的变化。结果表明：（1）随烟花发育时期推进，烟花花朵及烟草花序中CBT-diols、SE积累量均呈持续增加趋势，盛花期烟草花序CBT-diols、SE积累量最高。（2）随植烟海拔升高，烟草花序生物产量呈显著降低趋势，而烟花花朵CBT-diols、SE的积累量则均有显著升高的趋势;高海拔（2227 m）产地烟草花序SE积累量最高，而CBT-diols积累量却显著低于中高海拔产地（1938 m、1740 m）。（3）烟花发育时期及植烟海拔对CBT-diols、SE积累量的比值均有显著影响，烟花发育初期和高海拔条件下，二者比值较低。本研究为高附加值利用红花大金元烟花腺毛分泌成分提供了研究基础。

关键词：烟花;西柏三烯二醇;蔗糖酯;发育时期;植烟海拔

Abstract： Cembratrien-diols （CBT-diols） and sucrose esters （SE） are abundant in the glandular trichome secretion of Hongda tabacco flowers. To ascertain the effects of developmental stage and tobacco planting altitude on the glandular trichome secretion in tobacco flowers， Honghuadajinyuan tabacco flowers from Dali were selected to determine CBT-diols and SE by ultra-performance liquid chromatography and gas chromatography mass spectrometry. The results showed that： （1） With the progression of developmental stages， the accumulation of CBT-diols and SE in individual flower and inflorescence increased continuously， and the accumulation in inflorescence reached the highest level at full bloom stage. （2） With the increase of planting altitude， the biological yield of inflorescence evidently decreased， but the CBT-diols and SE levels in individual flower appeared to be increased; the SE level in inflorescence was the highest at high planting altitude （2227 m）， yet the level of CBT-diols was significantly lower than that at middle-high planting altitude （1938 m， 1740 m）. （3） The ratio of CBT-diols and SE accumulation was significantly influenced by planting altitude and developmental stage， which was the lowest at early tobacco flower development and high planting altitude. The results from this study provide a basis for the utilization of the waste resources of Hongda tabacco flowers with high added value.

Keywords： tobacco inflorescence; CBT-diols; SE; developmental stage; altitude

煙草花器官及叶片、茎表面均密被腺毛，西柏三烯二醇（cembratrien-diols， CBT-diols）及蔗糖酯类（sucrose esters， SE）化合物是烤烟腺毛分泌物的主要成分，其中西柏三烯二醇含量最为丰富，占腺毛分泌成分的60%以上[1-3]。烟草西柏三烯二醇及蔗糖酯类化合物是卷烟香气的重要前体物质[4]，西柏三烯二醇还具有抑菌、抗虫、神经保护、抗肿瘤等生物活性[5-6]。因此，烟草腺毛分泌物在卷烟本香香料、植物源农药、医药等方面均具有较好开发价值。据报道[4]，烟草花朵萼片腺毛分泌物量大于叶片。付秋娟等[7]研究证明，烟花是西柏三烯二醇含量最丰富的器官。烤烟是开花期打顶作物，目前，烟草花序在大田生产过程中大部分被废弃。关注烟花发育过程中表面活性成分的积累状况和影响因素，对于实现大田废弃烟花高附加值利用，提高烟草种植的经济效益，具有重要意义。

红花大金元（简称“红大”）是我国特色优质烤烟品种，因其香气量足、香气质好、吃味纯净、清香型风格突出等优良特性[8]，深受我国骨干卷烟品牌青睐。陈兴等[9]采用超临界CO2萃取红大烟花香料成分，并添加到卷烟中，结果表明，该天然香料对丰富烟香、提高卷烟舒适度具有一定应用价值。付秋娟等[7]通过对我国11份主要烤烟栽培品种分析发现，红大烟花西柏三烯二醇含量最高。本研究选择红大代表产区云南大理，分别研究了发育时期及不同植烟海拔对烟花腺毛主要分泌成分——西柏三烯二醇、蔗糖酯积累的影响，为红大烟花高附加值开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂与仪器

供试材料：试验地点设置在云南省大理州，供试烤烟品种为红花大金元，当地常规栽培方式种植。烤烟开花期（2019年6月下旬），选取红大烟花花朵（蕾）及花序为试验材料。

试剂：α-和β-2，7，11-西柏三烯-4，6-二醇（纯度95%，实验室制备），蔗糖八乙酸酯（纯度98%，美国Sigma公司），N，O-双三甲基三氟乙酰胺（纯度98%，美国AcrosOrganics公司），二甲基甲酰胺、95%乙醇、无水硫酸钠（分析纯，国药集团），乙腈（色谱纯，Merck公司），超纯水。

仪器：超高效液相色谱仪，配置紫外可见检测器（H-Class，美国Waters公司）;气相-质谱联用仪（7890A-5975C，美国Agilent公司）;水浴氮吹仪（WD-12，杭州奥盛仪器有限公司），恒温烘箱（DHG-9240A，杭州蓝天化药仪器厂）。

1.2 试验设计

1.2.1 不同发育时期烟花腺毛分泌成分积累动态 试验于大理州巍山县永建镇（海拔1740 m）进行，选择代表田块面积0.13～0.2 hm2，3次重复。

烟草花序发育时期设置3个处理（图1A）：（1）初花期，第一朵中心花开放;（2）盛花前，初花后3～5 d，大部分花朵盛开，但没有花朵萎谢及青果形成;（3）盛花期，初花后6～8 d，花朵盛开，有的花朵开始萎谢，形成1～2个以上青果。每田块选择不同花序发育时期的代表烟株30株，采集花序，称取其质量，计算不同时期打顶每公顷烟花产量，并用于提取花序腺毛分泌成分，每处理3次重复。

烟花花朵发育时期（图1B）设置6个处理：（1）蕾苞（长1.7 cm±0.1 cm），（2）花蕾（长3.5 cm±0.2 cm），（3）近开花（5.5 cm±0.2 cm），（4）盛开花（5.7 cm±0.2 cm），（5）近谢花（5.3 cm±0.2 cm），（6）青果（直径2.0 cm±0.1 cm）。于盛花期在代表田块选择生长一致的代表烟株15～20株，每株采集不同发育时期的花朵2～3朵，称量并计算各时期花朵的平均质量，每时期选取平均质量±0.01 g的5朵花朵进行测定，每田块2次重复，每处理共6次重复。

1.2.2 不同植烟海拔烟花腺毛分泌成分积累量的差异 设置3个处理：（1）大理州巍山县永建镇，海拔高度1740 m，（2）大理州洱源县三营镇，海拔高度1938 m，（3）大理州剑川县甸南镇，海拔高度2227 m。各处理选择长势均匀的初花期代表田块0.037～0.1 hm2，每处理3次重复。

烟草花序取样：初花期，各田块选择代表性烟株30株，花序采集及生产量的计算同1.2.1。

烟花花朵取样：各田块选取代表烟株10～15株，分别选取发育时期一致的近开花花朵材料，花朵取样方法及重复设置同1.2.1。

1.3 烟花腺毛分泌成分提取

1.3.1 烟花花朵或青果腺毛分泌成分提取 分别取称重后的5朵烟花花朵或青果，花蕾开放端朝下，放入50 mL具塞离心管中，准确加入20 mL 95%乙醇，室温下涡旋提取2 min，提取完成后，迅速倾出提取液，0～4 ℃冷藏保存，待测。

1.3.2 烟草花序腺毛分泌成分提取 将称重后的烟草花序材料放入不锈钢盆中，以95%乙醇为提取溶剂，液料比10：1，轻轻涮动提取，提取3次，每次提取时间2 min，将提取液合并、混匀，精确量取提取液体积，0～4 ℃冷藏保存，待测。

1.4 烟花腺毛分泌成分检测

西柏三烯二醇检测：参考付秋娟等[10]方法，将上述提取液用60%乙腈稀释至适宜浓度，过0.22 μm有机滤膜，液相色谱测定，2次重复。

蔗糖酯检测：参考蔡莉莉等[11]方法，分别取上述提取液5 mL，氮气吹干，加入含有蔗糖八乙酸酯的乙酸乙酯内标溶液（0.06 mg/mL）50 μL，氮气吹干。加入500 μL 二甲基甲酰胺和N，O-双三甲基三氟乙酰胺混合液（体积比1：1），在75 ℃加热（衍生化）1 h，过0.22 μm有机滤膜，GC/MS测定，以蔗糖八乙酸酯为内标进行半定量分析。GC/MS色谱条件为：色谱柱为HP-MS，30 m×250 μm×0.25 μm，载气为氦气，流速1.0 mL/min，进样口温度290 ℃，分流模式进样，进样量1 μL，分流比3：1，色谱柱起始温度230 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至270 ℃，保持2 min，以1℃/min升至290 ℃，保持4 min。质谱传输线温度：280 ℃;四级杆温度150 ℃;EI离子源温度230 ℃;电离能量70 eV;质量扫描范围30～550 amu。

1.5 烟花花朵/花序腺毛分泌成分积累量计算

烟花花朵或青果西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量分别以两种方式表示：（1）每朵烟花或青果目标化合物的积累量，单位为μg/朵;（2）单位鲜质量烟花花朵或青果目标化合物的积累量，单位为μg/g。烟草花序西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量以每公顷烟株花序生产目标化合物的质量表示，单位为kg/hm2。

1.6 數据分析

用SAS 9.4软件进行数据统计，采用Duncan新复极差法分析数据显著性，p<0.05为显著差异，p<0.01为极显著差异，并利用Excel 2010软件作图。

2 结 果

2.1 发育时期对烟花腺毛分泌成分积累量的影响

2.1.1 不同发育时期烟花花朵腺毛分泌成分积累动态 由表1可以看出，随着发育进程推进，单位质量烟花和单朵烟花中西柏三烯二醇、蔗糖酯的积累规律并不一致。从单位质量烟花来看，西柏三烯二醇积累量在蕾苞至近开花时期变化不显著，均处于较低水平，盛开花时期开始显著升高，于近谢花时期达最高水平后迅速降低;蔗糖酯的积累量在蕾苞期和花蕾期即处于较高水平，近开花时期开始下降，且与盛开花、近谢花时期无显著差异，青果形成后又显著降低。从单朵烟花来看，西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量均呈上升趋势，并于烟花近谢时期达最高水平，青果形成后，西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量又显著降低。

在不同发育时期，烟花西柏三烯二醇与蔗糖酯积累量的比值也存在较大差异。蕾苞至花蕾期，二者比值较低，烟花接近开放时二者比值迅速升高并稳定保持至盛开期及近谢期，至青果形成时二者比值又迅速升高。

2.1.2 不同发育时期烟草花序腺毛分泌成分积累动态 由表2看出，随发育时期推进，烟草花序产量呈极显著升高趋势，西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量及其二者比值也呈极显著升高的趋势。盛花期打顶烟草花序西柏三烯二醇、蔗糖酯的积累量分别是初花期的3.2、2.3倍。因此，随打顶时期推迟烟草花序西柏三烯二醇和蔗糖酯积累量增加，盛花期打顶可得到最高积累量。

2.2 植烟海拔对烟花腺毛分泌成分积累量的影响

2.2.1 不同植烟海拔烟花花朵腺毛分泌成分积累动态 由表3看出，随植烟海拔升高，红大烟花花朵西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量呈升高趋势。其中，剑川（海拔2227 m）和洱源（海拔1938 m）烟花花朵西柏三烯二醇积累量差异不显著，但显著高于巍山（海拔1740 m）;剑川（海拔2227 m）烟花花朵蔗糖酯积累量显著高于洱源（海拔1938 m）、巍山（海拔1740 m），而洱源、巍山之間差异不显著。不同海拔之间，烟花花朵西柏三烯二醇积累量最高值（剑川）是最低值（巍山）的1.3倍，而蔗糖酯积累量最高值（剑川）是最低值（巍山）的1.6～1.7倍，因此，植烟海拔对烟花蔗糖酯积累量的影响更大。高海拔条件下，烟花花朵西柏三烯二醇与蔗糖酯积累量的比值最低。

2.2.2 不同植烟海拔烟草花序腺毛分泌成分积累动态 由表4看出，随植烟海拔升高，红大烟草花序产量呈降低趋势，这可能与随海拔高度增加，烟花生长期内的积温降低有关。高海拔（2227 m）产地剑川烟花花序蔗糖酯的积累量最高，显著高于巍山、洱源，而巍山、洱源之间差异不显著。高海拔（2227 m）产地剑川烟花花序西柏三烯二醇积累量相对较低，显著低于巍山、洱源。不同植烟海拔条件下，烟草花序西柏三烯二醇与蔗糖酯积累量的比值也存在较大差异，高海拔条件下，二者比值最低。

3 讨 论

本研究表明，烟花在蕾苞期即具有较高的西柏三烯二醇、蔗糖酯积累水平，随着发育进程推进，西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量升高，至烟花凋谢前达最高，形成青果后，由于部分腺毛随花冠脱落而遗失，个体青果中西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量显著低于花朵。随烟花发育时期推进，烟草花序产量及其西柏三烯二醇、蔗糖酯的积累量均呈持续增加趋势。大田生产中，盛花期打顶，花序中提取获得的烟花西柏三烯二醇、蔗糖酯的量最多。但在实际应用中，要根据烟草开花期的大田长势、长相，综合考虑打顶时期对烤烟烟叶产量、质量、经济性状以及烟花西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量的影响，确定适宜的打顶时期。

海拔高度对温度、光照、降雨及土壤等生态条件均有重要影响，也是影响烟草腺毛分泌成分的重要环境因素。但是，不同研究者有关植烟海拔对烟草腺毛分泌成分影响的报道存在差异。韩锦峰等[12]研究表明，河南产区620～1000 m海拔范围内，随海拔升高，中部烟叶西柏三烯二醇含量呈降低趋势;毕庆文等[13]发现，恩施产区海拔800～1200 m区域各等级烟叶类西柏烷物质总量均明显高于500～800 m区域;赵华新等[14]研究表明，贵州毕节产区840～2100 m海拔范围内，云烟87和云烟97烤烟成熟期的西柏三烯二醇含量表现为高海拔地区>低海拔地区，而毕纳1号无论在低海拔和高海拔地区西柏三烯二醇含量均较高。本研究表明，植烟海拔1740～2227 m范围内，红大烟花花朵西柏三烯二醇、蔗糖酯积累量均随海拔升高呈显著升高趋势。以上研究结果存在较大差异的原因，一方面由于不同研究者选择的海拔区间差异较大，植烟海拔对烟草腺毛分泌成分的影响规律可能存在较大差异;另一方面，可能与选择的烟草品种有关，不同品种腺毛分泌成分量对海拔高度的敏感性可能存在差异。

根据本研究结果，烟花发育时期及植烟海拔对烟花西柏三烯二醇与蔗糖酯的比值均有显著影响，烟花发育初期和高海拔条件下，二者比值均较低。作为卷烟香气成分的重要前体物，西柏三烯二醇、蔗糖酯对卷烟香味和风格特征贡献的效应不同。卷烟燃烧过程中，西柏三烯二醇热解，生成茄酮、降茄二酮等香味成分，赋予卷烟甜的酮味，增加烟草本香使烟气更加丰满醇和;蔗糖酯热解可以释放出低级羧酸，赋予烟气吸味芳香特征，能使烟气变得细腻、醇和[1]。因此，提取物中西柏三烯二醇、蔗糖酯组成比例的差异，也会对卷烟香吃味品质及其风格特征产生较大影响。因此不同卷烟品牌可根据需求选择适宜发育时期及植烟海拔的烟草花序作为提取原料。

烟草西柏三烯二醇不仅对苹果腐烂病等植物病原真菌具有较好抑制活性[15-16]，对人体肝癌细胞系HepG2也具有良好抑制效果[17]，在植物源杀菌剂、医药方向具有较好开发价值。因此，本研究也为开发大田废弃烟花在植物源杀菌剂、医药方向的利用价值提供了研究基础。

4 结 论

试验结果表明，随烟花发育时期的推进，烟花花朵及烟草花序中CBT-diols、SE的积累量均呈持续增加趋势，盛花期烟草花序中CBT-diols、SE积累量最高;随海拔升高，烟花花朵中CBT-diols、SE积累量均有显著升高的趋势;高海拔产地烟草花序SE的积累量较高，而CBT-diols积累量却显著较低;烟花发育初期和高海拔条件下CBT-diols/SE的比值较低。本研究为高附加值利用红大烟花废弃资源提供了研究基础。

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