广东梅香鱼生物胺含量分析研究

陶志华，刘伟锜，乔娜，谢姝颖，陈泳琪，曹楚珩，何妍庆，梁绮琦，钟家本

(广东工业大学 轻工化工学院，广州 510006)

1 概述

梅香鱼(又名酶香鱼)是广东等沿海高温地区的一种盐渍自然发酵鱼制品，在广东沿海地带作为配菜佳肴，颇具盛名。梅香鱼在盐渍过程中通过内源酶的自溶和微生物的发酵作用，产生特殊的梅香气味[1]。鱼在发酵过程会伴随大量微生物的存在，微生物代谢作用会使蛋白质分解产生大量游离氨基酸、多肽和有机酸等风味物质，赋予腌制鱼特殊的风味。而氨基酸又可能会在微生物的进一步作用下产生有害的代谢产物，生物胺就是其中微生物代谢的有害代谢物质，是在适宜条件下，鱼肉中大量游离氨基酸在微生物的氨基酸脱羧酶作用下产生的，摄取过量的胺类会引起食物中毒现象，尤其是组胺，摄入过量的组胺会引起头疼、恶心、呕吐、痉挛，严重的会危及生命，其次是酪胺，尸胺和腐胺会加重组胺中毒症状[2-6]。而且生物胺能与咸鱼中常存化合物亚硝酸钠生成亚硝基胺类化合物，引起癌变[7]，鱼类生物胺严重影响人体健康，从而产生严重贸易壁垒。美国FDA设限进口水产品组胺不得超过 50 mg/L, 酪胺≤100 mg/L，总生物胺含量不得超过1000 mg/L；欧盟规定鲭科鱼制品组胺含量不能超过100 mg/L[8]；我国制定的GB 2733-2005中对组胺限量的规定：鲐鱼不能大于100 mg/100 g，其他鱼类则不能大于30 mg/100 g[9]。鲭科鱼因含有大量的游离氨基酸易引起生物胺的累积，而鲭科鱼加工的梅香鱼制品的生物胺相关调查分析研究知之甚少，梅香鱼可作为佐餐配料，是直接加工食用的咸鱼，为广东沿海的热销鱼制品，所以展开梅香鱼生物胺含量的调查，为梅香鱼的食品安全控制提供了非常重要的参考数据。

2 实验材料与方法

2.1 材料

市售梅香鱼20块(梅香鱼个体大，超市切块封装卖，市场切卖)。

2.2 试剂

盐酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙酸铵、三氯乙酸：广州华鑫科技有限公司；组胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亚精胺、苯乙胺标准品、乙腈、二甲氨基萘磺酰氯：Sigma公司。

2.3 仪器

搅拌器、离心机、恒温干燥箱、真空抽滤器；高效液相色谱仪(HPLC) 日本岛津公司。

2.4 试剂的配制

5%三氯乙酸溶液：称得25 g三氯乙酸，用水溶解，然后用容量瓶定容并稀释至500 mL。

乙酸铵溶液(0.1 mol/L)：称取3.584 g乙酸铵，用水稀释定容至500 mL，备用。

饱和碳酸氢钠溶液：称取15 g碳酸氢钠，溶于100 mL水中，置于试剂瓶中备用。

盐酸(1 mol/L)：量取8.6 mL浓盐酸，用水稀释定容至100 mL。

二甲氨基萘磺酰氯(10 mg/mL)：称取1 g二甲氨基萘磺酰氯，溶于100 mL丙酮中，混匀置于棕色瓶中，避光保存。

氢氧化钠溶液(1 mol/L)：精准称得4 g氢氧化钠，然后倒入100 mL水完全溶解，备用。

生物胺标准品(1000 mg/L)：分别配制组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、酪胺、精胺、亚精胺的标准品，分别称取0.01 g，依次倒入8个10 mL小烧杯内，加入浓度为0.1 mol/L的盐酸溶液对这8种样品进行溶解，以0.1 mol/L盐酸为定容液体到需求的刻度，充分搅拌至均匀，配制成浓度为1000 mg/L的标准备用溶液，放入-20 ℃的冰箱中保存。

2.5 实验方法

2.5.1 标准曲线的制备

将配制好的8种生物胺标准品分别用0.1 mol/L的盐酸稀释至10.0，15.0，25.0，50.0，100.0 mg/L不同浓度的标准溶液，然后取0.5 mL，加入50 μL 2 mol/L氢氧化钠溶液、1.5 mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，振荡混合均匀，置于40 ℃培养箱中避光反应45 min，中间振荡2次，取出，加入0.1 mL 25%氨水暗处静置30 min，再置于60 ℃水浴15 min除去丙酮，冷却至室温后用乙腈定容至5 mL，振荡混匀，再用0.22 μL有机膜过滤后上机待测，得到峰面积，将其作为纵坐标，而浓度作为横坐标，获取8种生物胺的标准样品浓度的线性关系。

2.5.2 样品生物胺的提取及衍生

精准称得鱼肉样品约5.0 g，对其进行剪碎处理，然后放入100 mL锥形瓶中，倒入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，充分振荡提取1 h，使用3600 r/min的离心设备离心10 min，然后对上部的清液进行提取，重复进行2次，然后以5%三氯乙酸为定容液体到25 mL，最后借助0.45 μL的有机膜进行过滤处理。

样品的衍生：精准量得样品0.5 mL，各自倒入50 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液、1.5 mL处于饱和状态的碳酸氢钠溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，充分振荡混合后，使其达到均匀，然后放到40 ℃的水浴锅内在无光的照射下进行45 min的充分反应，期间要进行2次振荡操作，完成后导出，倒入0.1 mL 25%氨水在无光亮的环境中放置30 min，之后移动到60 ℃水浴锅内15 min，目的是清除丙酮，冷却至室温后，以乙腈为定容液到需求的5 mL，充分搅拌至均匀，借助0.22 μm的有机膜进行过滤处理，之后放入小容器瓶内，等待机器测试。

2.5.3 高效液相色谱条件

色谱柱为 C18柱(柱长15 mm，柱内径4.6 mm，柱填料内径5 μm)，紫外检测波长为254 nm, 进样量为10 μm，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL/min，流动相A为 0.1 mol/L乙酸铵，流动相B为纯乙腈，两流动相在洗脱前需进行抽滤，并采用超声仪器去除气泡。通过样品峰面积比对标准样品峰面积计算生物胺含量。

3 结果与分析

3.1 线性关系

标准品通过浓度变化得到的峰面积作为纵坐标，而浓度作为横坐标，测定可得8种生物胺的线性关系方程，见表1。

表1 生物胺的线性关系分析结果Table 1 The results of linear analysis of biogenic amines

续 表

在这8种生物胺标准品中，它们的浓度介于10～100 mg/L之间，有极好的线性关联，对应的关联参数中，除精胺(0.9796 μL)、亚精胺(0.9434 μL)外，其余都在0.99 μL以上，能够满足本实验生物胺的检测需要。

3.2 梅香鱼生物胺含量分析结果

由表2得到生物胺的检出率为：色胺40.0%，苯乙胺95.0%，腐胺100%，尸胺100%，组胺95.0%，酪胺100%，亚精胺75.0%，精胺85.0%。

表2 市售腌制鱼生物胺含量情况Table 2 The content of biogenic amines incured fish mg/kg

国家卫生部的标准GB 2733-2005中对组胺含量的规定为:鲐鱼≤100 mg/100 g，其他鱼类≤30 mg/100 g的限量标准，组胺超出限量的有17条，所占比例为85%，组胺含量最高可达到132.4 mg/100 g，超出规定限量3.4倍。

根据美国食品药品监督管理局(FDA)对生物胺的限量标准：水产品中的限量为组胺≤50 mg/kg，酪胺≤100 mg/kg。此次调查中，20份样品中19份样品的组胺含量均超过限量，超出限量的样品比例为95%，所有样品中酪胺的含量均超出限量，超出限量的样品比例为100%。

除组胺与酪胺外，苯乙胺、腐胺、尸胺的检出率均在90.0%以上，亚精胺与精胺的检出率也在70.0%以上，通过本次调查分析，表明售梅香鱼的生物胺含量存在极大的安全隐患。

4 结论

通过本次调查结果分析得到：色胺检出率为40.0%，苯乙胺为95.0%，腐胺为100%，尸胺为100%，组胺为95.0%，酪胺为100%，亚精胺为75.0%，精胺为85.0%。依照美国食品药品监督管理局(FDA)针对生物胺的标准使用量的规定，其中组胺的最高检出含量为132.4 mg/100 g，已经远远超出限定量，超出限定量所占比例为95%。苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺的检出率均在90.0%以上，亚精胺与精胺的检出率也在70.0%以上。除组胺与酪胺外，以上其他6种生物胺各国虽无限量规定，但尸胺和酪胺能够抑制肠道中二胺氧化酶和组胺-N-甲基转移酶的活性，降低组胺分解，加强了组胺的毒性作用[10]。腐胺、尸胺等则能够与亚硝酸盐反应生成亚硝胺等杂环类致癌物质，其含量也不可忽视。

综上所述，部分市售腌制鱼中生物胺含量严重超过限量标准，市售腌制鱼仍然存在一定安全隐患，为了保证梅香鱼的安全性，加工储藏工艺还需要进一步改进。