基于网络药理学的乌梅抗结直肠癌机制研究

潘雨烟，罗梦雪，方霜霜，徐楚楚，苏晓兰，魏 玮

（1. 中国中医科学院望京医院脾胃病科，北京 100102；2. 北京中医药大学研究生院，北京 100029；3. 功能性胃肠病中医诊治北京市重点实验室，北京 100102）

结直肠癌是世界排名第三的恶性肿瘤，在世界癌症死亡原因中排第四［1］。且近年来，结直肠癌在发展中国家的发病率显著上升［2-4］，为我国造成了严重的健康负担及经济负担［5，6］。中医药对于结直肠癌的认识历史久远，在整体观念和辨证论治思想指导下能够参与结直肠癌的全程治疗，对于控制病情进展、减轻癌症放化疗不良反应、提高患者生存质量等方面具有明显优势，能够在整体治疗过程中起到至关重要的作用［7］。

乌梅（Fructus mume）为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.etZuce.的干燥近成熟果实，始载于《神农本草经》，性平，味酸、涩，归肝、脾、肺、大肠经。《本草从新》记载其可涩肠敛肺，止血涌痰，消肿解毒，生津止渴，治久嗽泻痢，血痢尤良。其化学成分主要包括萜类、甾醇类、黄酮类、糖类、生物碱等，具有抗菌、抗病毒性肝炎、抗肿瘤、抗氧化等作用［8］。徐超［9］用乌梅提取物对AOM-DSS 诱导的肠病癌变小鼠进行干预，结果发现，乌梅能够预防肠道炎癌转化，对于AOM-DSS 诱导的肠病可起到防止向肠癌转化的作用。然而乌梅的成分较多，其抗结直肠癌的作用机制尚未得到揭示。基于此，本文利用网络药理学方法搜集出乌梅中潜在的有效物质，并对抗结直肠癌作用靶点及药理活性进行预测，建立药物-靶标-疾病相互关系网络并进行分析，揭示乌梅抗结直肠癌的潜在作用机制，为更深入的实验研究提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 乌梅主要活性成分与靶点的搜集与筛选

利 用TCMSP 数 据 平 台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索乌梅所含的所有化学成分，通过口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 对所有化学成分进行筛选，并在TCMSP 平台检索主要活性成分的靶点，同时，借助Uniprot（http：//www.uniprot.org/）数据库查找所得基因靶点的基本信息。限定物种为人，对靶点基因名称进行校正，剔除没有靶点的化学成分及多余的重复项。

1.2 乌梅抗结直肠癌潜在作用靶点的预测

以“Colorectal Cancer”为关键词，通过Genecard数据库、DisGeNET 数据库检索获取结直肠癌相关靶点，与乌梅化学成分靶点映射，得到共同靶点作为乌梅抗结直肠癌潜在靶点，建立数据集。

1.3 乌梅相关活性成分-作用靶点网络构建与分析

将乌梅的活性成分与抗结直肠癌的潜在靶点导入Cytoscape3.7.2 软件，构建乌梅抗结直肠癌的活性成分-作用靶标网络。

1.4 乌梅抗结直肠癌相关靶标相互作用网络构建与分析

将潜在靶点导入STRING 数据库，物种选定为“homo sapiens”，获得蛋白相互作用关系，设置信度分值大于0.7，隐藏无蛋白互作关系的靶点，以TSV格式保存结果。再将数据导入Cytoscape3.7.2 软件进行可视化处理和分析。

1.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

采用在线分析系统DAVID 对乌梅抗结直肠癌的靶点进行GO（Gene Ontology）基因功能富集及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，设定阈值P＜0.05，筛选具有显著性差异的生物过程。

2 结果

2.1 乌梅主要活性成分与靶点的搜集与筛选

本研究通过TCMSP 数据库共检索到乌梅成分40 个，根据OB 和DL 参数筛选到生物活性成分8个，见表1。得到蛋白靶点194 个，通过Uniprot 数据库统一命名并去重后，得到178 个靶点。

表1 乌梅活性成分信息Tab 1 Basic information of active components in Fructus mume

2.2 乌梅抗结直肠癌潜在作用靶点的预测

通过Genecards 和DisGeNET 数据库中筛选出与结直肠癌相关的基因共11 085 个。为提高研究结果准确性，根据相关度大小取每个数据库前300个靶点组建结直肠癌相关靶点数据库，去重后得到513 个结直肠癌相关靶点。与乌梅活性成分178 个靶点取交集，得到58 个可能与乌梅抗结直肠癌相关的作用靶点，见图1。

图1 “乌梅-结直肠癌”基因映射Venn 图Fig 1 Venn map of“Fructus mume-colorectal cancer”gene mapping

2.3 乌梅相关活性成分-作用靶点网络构建与分析

通过Cytoscape3.7.2 软件构建成分-作用靶标网络，其中红色节点表示乌梅的活性成分，黄色节点表示结直肠癌靶点，边线表示两者的相互作用关系，见图2。

图2 乌梅抗结直肠癌的活性成分-靶标网络图Fig 2 Chemical components and target networks of Fructus mume in the treatment of colorectal cancer

2.4 乌梅结直肠癌相关靶标PPI 网络的构建与分析

在STRING 数据库构建共有靶点的蛋白互作PPI 网络，将数据导入Cytoscape3.7.2 软件，利用软件分析和处理，网络中节点大小反应Degree 值的大小。按Degree 从高到低排序依次为：TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF、IL6 等，见图3、图4。

图3 STRING 平台PPI 蛋白互作网络Fig 3 PPI protein interaction network of STRING platform

图4 靶标相互作用网络Fig 4 Target interaction network

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

利用DAVID 在线平台对乌梅抗结直肠癌的靶点进行富集分析，根据P＜0.05 确定对应的条目，通过OmicShare 平台绘制气泡图。

GO 功能富集分析得到相关条目108 条。其中生物过程（biological process，BP）相关条目87 条，涉及DNA 损伤的内源性信号通路反应、基因表达正调控、细胞因子反应等方面：细胞组成（cellular nucleus，CC）相关条目7 条：细胞质、细胞外、细胞核、线粒体组成等；分子功能（molecular function，MF）相关条目14 条：蛋白质二聚体活化、生长因子活化、蛋白结合、转录因子结合等方面。生物学过程、细胞组成、分子功能3 个模块分别生成的前10条相关条目信息，见表2、图5～7。

表2 GO 功能富集分析Tab 2 GO functional enrichment analysis

图5 GO 功能富集的BP 分析Fig 5 BP analysis of GO functional enrichment

图6 GO 功能富集的CC 分析Fig 6 CC analysis of GO functional enrichment

图7 GO 功能富集的MF 分析Fig 7 MF analysis of GO functional enrichment

KEGG 通路富集分析得到相关条目88 条，涉及癌症信号通路、蛋白聚糖在癌症中的信号通路、结直肠癌、p53 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路等，前20 条相关信息，见表3、图8。

表3 KEGG 信号通路富集分析Tab 3 Enrichment analysis of KEGG signal pathway

图8 KEGG 通路富集分析Fig 8 Enrichment analysis of KEGG pathway

3 讨论

本研究结果显示，乌梅中有多种活性成分可通过多个基因靶点、多信号通路对结直肠癌产生影响，本研究检索出乌梅抗结直肠癌相关活性成分包括β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素为一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种生理功能［10］，流行病学报告显示，摄入富含槲皮素的食物可降低消化道肿瘤如胃癌及结直肠癌的发生风险［11，12］；其抗结直肠癌的作用可通过多种途径和机制发挥，Zhou等［13］通过定量蛋白组学分析方法发现槲皮素可通过干扰CCND1 基因表达、诱导细胞增殖G1期阻滞、诱导细胞形态学改变等途径在HepG2 细胞中发挥抗肿瘤活性。国外相关研究证实槲皮素作用于HT-29 结肠癌细胞后可提高p53 蛋白的表达水平，诱导HT-29 结肠癌细胞凋亡［14］。山奈酚具有良好的抗肿瘤作用，研究证实山奈酚对HCT-116、HCT-15、SW480 等大肠癌细胞具有较强的细胞毒性、抗氧化、抗增殖及凋亡作用［15］。β 谷甾醇具有抗肿瘤活性，研究表明其对乳腺癌、前列腺癌、及胰腺癌细胞均具有抑制作用［16-18］，β-谷甾醇还可减少结肠癌细胞PCNA 抗原的表达，通过清除活性氧诱导肿瘤细胞COLO320DM 凋亡，进而抑制结直肠癌的发生发展［19］。

根据本研究结果，乌梅作用于结直肠癌的关键靶 点 包 括TP53、AKT1、MAPK8、JUN、MAPK1、TNF、EGF 等。其中TP53 是编码p53 的抑癌基因，可由于基因缺失等因素引起失活，进而使p53 蛋白功能受限，引起p53 通路功能紊乱，这种现象在人类肿瘤中常有出现，且在结直肠癌发生发展中具有关键作用［20］，已有研究表明，TP53 的剪接突变与结直肠癌患者生存预后较差相关［21］。通过实验研究发现在大鼠体内联合灭活TP53 和MIR34A 可增加IL6、PAI1 的水平，促进致癌剂AOM 诱导的结直肠癌的发生以及肿瘤的进展和转移［22］。AKT1 为AKT 的一个亚型，研究发现，p-Akt1 在肠道肿瘤部位阳性率明显高于正常肠道黏膜组织［23］。AKT1 的磷酸化激活可介导FoxO 下调cyclin D1、cyclin D2表达，促进细胞周期循环，进而促进肿瘤的发生发展；抑 制AKT1，则 有 较 强 的 抗 肿 瘤 作 用［24］。MAPK8 基因参与编码JNK 蛋白激酶，该蛋白为MAPK 通路的一种亚家族，在大肠癌的发生发展中，MAPK 可调控大肠癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增 殖、侵 袭 与 转 移［25］。c-jun 是JUN 基 因 的 一 种 蛋白，为结直肠癌的易感性基因，c-Jun 的表达与结直肠癌患者的生存预后相关［26］。表皮生长因子EGF能够促进肿瘤细胞增殖，促进其浸润和转移，参与多种器官纤维化，研究表明，EGF 在结直肠癌组织中的表达明显升高［27］。通过靶点预测，筛选出乌梅抗结直肠癌的主要靶点还有TNF、MAPK1、MYC、IL6、VEGFA、CCND1、CASP3 等基因，表明乌梅可通过多靶点抗结直肠癌。

本研究通过GO 富集分析和KEGG 通路富集分析发现，乌梅可能通过调控p53、HIF-1、TNF 等信号通路发挥抗结直肠癌的作用。抑癌基因p53 是一种公认的与肿瘤清除过程相关的基因，通过p53 磷酸化可激活促凋亡基因的转录，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而发挥作用［28，29］。研究表明，p53 激活可通过上调CHOP 蛋白介导的DR4、DR5 的表达，增加促凋亡蛋白的表达和ROS 生成，从而增加TRAIL 介导的细胞凋亡［30］。此外，Xu 等［31］研究发现FOXD 3 可与p53 结合，增强其表达能力，从而诱导结直肠癌肿瘤细胞凋亡。缺氧诱导因子HIF-1 在低氧环境下表达增加，生成血管，提高能量代谢和氧运输，维持肿瘤细胞稳定，从而使肿瘤细胞适应缺氧［32］。相关研究表明［33-35］，HIF-1α 在结直肠癌局部和转移瘤中均有较高的表达，阻断HIF-α 通路可减少糖酵解相关酶GLUT-1 和LDH-A 的表达，减少肿瘤细胞分泌的乳酸含量，从而起到抑制肿瘤细胞的作用。TNF-α 为肿瘤坏死因子，由肿瘤相关巨噬细胞分泌，可诱发慢性炎症，从而促进肿瘤的侵袭发展［36］。研究表明［37，38］，TNF-α 可激活NF-κB 及AP-1，进 而 启 动IL-8 及MMPa 的 表 达，上 调CD44V6 与透明质酸结合，促进肿瘤定植。通过实验研究及临床证据推测，以上信号通路可能在乌梅抗结直肠癌中发挥作用。

综上，本文通过网络药理学的方法发现乌梅中β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素等多种成分可作用于TP53、AKT1、MAPK8、JUN、EGF 等靶点，通过调节p53、HIF-1、TNF 等信号通路来发挥抗结直肠癌的作用，为进一步药理研究及临床应用提供了一定的理论基础，乌梅能否成为治疗肿瘤的药物，还需要更多相关实验研究及理论探讨以明确。