NLRP3-ASC-Caspase-1 信号通路在慢性心力衰竭患者外周血单核细胞中的表达

2021-08-07 06:28朱飞宇徐庆梅康品方王洪巨
海南医学院学报 2021年14期
关键词:细胞因子试剂盒通路

朱飞宇,徐庆梅,朱 建,汤 阳,高 琴,唐 碧,康品方,王洪巨

(蚌埠医学院 1.第一附属医院心血管科,2.心脑血管疾病基础与临床重点实验室,3.生理学教研室,安徽 蚌埠 233000)

心力衰竭(HF)是由于心脏功能的各种结构或功能受损导致无法在正常充盈压下维持心输出量所致[1,2]。随人口老龄化及城镇化进程的加速,中国心血管病呈明显上升趋势,且心力衰竭发病率高、预后差,年病死率高达40%[3],慢性心力衰竭已成为重大公共卫生问题.导致慢性心力衰竭患者死亡的主要病种变化趋于一致,我国和欧美国家均以冠心病和/或高血压为主。

有大量研究表明,人类和动物模型中的慢性心力衰竭与炎症有关[4]。心力衰竭中的无菌炎症是由危险相关分子模式(DAMPs)引发的,并已被证明可导致不可逆的心肌病变,例如纤维化,细胞凋亡和肥大[5-7]。DAMPs 激活Toll 样受体引起通常包括核因子κB,Toll 样受体4 信号和诱导炎性趋化因子,细胞因子的表达进而招募中性粒细胞、巨噬细胞和T 细胞。虽然这一过程最初在防止进一步的组织损伤方面起到有益的作用,但如果持续,就会导致慢性炎症。心脏压力的升高和不良的泵功能直接触发炎症细胞的活化,例如外周单核细胞,这些细胞在心脏中聚集并释放到循环中[8,9]。人PBMCs 包括单核细胞及淋巴细胞,是慢性炎症的重要参与者,能分泌包括IL-1β 和TNF-α 等在内的多种细胞因子和化学介质,介导炎症的发生和发展。

NLRP3 炎性小体是一种细胞内相互作用蛋白的复合物,可识别DAMPs 并触发促炎细胞因子的成熟,从而引发和增强炎症反应[10-12]。NLRP3 炎性小体由核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体,细胞凋亡相关斑点样含有胱天蛋白酶募集结构域蛋白(ASC)和半胱天冬酶组成。炎性体的形成导致半胱天冬酶-1(Caspase-1)活化。Caspase-1 进一步切割各种底物,包括细胞因子白介素-1β 前体和白介素-18 前体[13]。IL-1β 是一种具有多种生物活性的前炎性因子,而白介素-18 是新近发现的细胞因子,由PBMCs 及脾细胞等产生[14],NLRP3 炎 性小体还可以caspase-1 依赖性方式诱导细胞凋亡[15]。通过细胞凋亡引起的心肌细胞损失减少了收缩储备,导致心力衰竭的发展[16]。在NYHA Ⅲ级和Ⅳ级患者,EF 降低(<40%)的患者心肌组织中,发现急性心肌炎患者的样本中含有更多的含炎性小体的白细胞[17]。虽然仅存在关联性,并没有显示因果关系,但是在受损和受压的心肌细胞中不断增加的炎性小体,提示其在心力衰竭的发病机理和恶化中起了重要作用。尽管NRLP3 炎性体与慢性心力衰竭的发生有关,但不良的心肌重塑机制尚不完全清楚。有必要做进一步的工作来阐明心力衰竭的发病机理和恶化的心肌重塑和修复机制。

因此,本研究旨在通过深入探讨PBMCs 上NLRP3 炎症体通路参与慢性心衰发生的分子机制,进一步揭示NLRP3 炎症体通路与慢性心衰之间的信号网络,可能有助于对这一特殊疾病分子机制的认识,并且为治疗和改善预后提供新方法和新策略,具有重要的科学价值和临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年10 月~2019 年12 月在本院接受治疗的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级慢性心衰患者(NYHAⅡ~Ⅳ级)各20 例为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,慢性心力衰竭根据2018 年中国心力衰竭治疗和诊断指南诊断[18]。临床症状为急性感染、严重肾功能衰竭(血清肌酸水平>3 mg/dL)或类风湿性疾病,或怀疑有恶性或原发性消瘦障碍的患者被排除在本研究之外。选择20 名健康人为对照组。本研究参与者年龄为41~84 岁,本研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会(中国蚌埠)批准,并获得所有受试者的书面知情同意。各组间年龄、性别、血糖水平、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿酸(UA)比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 试剂

人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技 有 限 公 司);NLRP3 抗 体(Abcam 公 司lot:GR3192189-4);ASC、Caspase-1 抗 体(Novus Biologicals 公 司CAT#DF6148,CAT#VF6304);β-actin 抗体(protintech 公司Cat #20536-1-AP);免疫磁珠试剂盒(STEMCELL Technologies 公司lot#19D1011661);Trizol 试剂、荧光定量检测试剂盒、第一链合成试剂盒(TIANGEN 公司CAT#DP405-02,CAT#FP205-02,CAT#KR106-02);引物(上海生工生物工程有限公司),序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 实验方法

1.3.1 标本准备与PBMCs 分离 标本准备:通宵禁食后的清晨采集所有患者的外周血置于EDTA抗凝管中,2 h 内以2 500 r/min 离心15 min,取离心后的上层血浆,血浆于-80 °C 保存。

PBMCs 分离:(1)在15 mL 离心管加入淋巴细胞分离液(稀释血∶淋巴细胞分离液=1∶1);(2)用生理盐水将抗凝血稀释1 倍,充分混匀。缓慢加至淋巴细胞分离液层面上(将装有淋巴细胞分离液的离心管倾斜,缓慢注入稀释血,切勿冲散破坏液面分层),以2 000 r/min 离心20 min. 离心机温度为20~25 ℃。(3)用移液管插到PBMC(云雾层混浊带)层,沿管壁轻轻吸出此层细胞,把灰白色淋巴细胞层加入15 mL 离心管中并向该管加入生理盐水至10 mL 重悬细胞;(4)4 ℃、3 000 r/min 离心7 min,弃上清,加入红细胞裂解液重悬细胞,裂解5 min 后,4 ℃、1 500 r/min 离心10 min,再补满生理盐水继续离心10 min。弃上清,继续补满生理盐水继续1 500 r/min 离心10 min。弃上清;(5)4 ℃、4 000 r/min 离心5 min。用移液枪吸出残留液体,加入配置好的血清(胎牛血清∶二甲基亚砜=9∶1)重悬细胞,转移至冻存管。-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 qRT-PCR 检测NLRP3 通路相关基因在PBMCs 中的表达水平 使用TRIzol 试剂提取细胞总RNA,根据miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(TIANGEN,cat.KR211)说明书将RNA 转化为cDNA,根据miRNA 荧光定量检测试剂盒(TIANGEN,cat.FP411)说明书进行荧光定量。用β-actin进行校正,以正常组作为对照,用2-ΔΔt法进行相对数据处理,计算炎症相关基因的表达率。

1.3.3 Western blot 检测NLRP3 通路相关蛋白在PBMCs 中的表达情况 使用前期提取的PBMCs,冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min 离心30 min,提取细胞总蛋白,BCA 蛋白定量法(参照试剂盒说明书操作)测定各组蛋白浓度,加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液,100 ℃煮沸5 min。每组取50 μg 蛋白,10% SDS-PAGE 电 泳(60 V,30 min;90 V,100 min);转膜(200 mA,2~3 h)至PVDF 膜;5%脱脂牛奶室温封闭4 h(或4 ℃过夜);一抗室温孵育4 h(或4 ℃过夜);TPBS 洗涤3 次,10 min/次;二抗室温孵育2 h;TPBS 洗涤3 次,10 min/次;ECL 发光试剂盒发光,凝胶成像系统获取图像。

1.3.4 ELISA 法检测各组血浆中IL-1β 水平 根据生产商说明,使用ELISA 法测定血浆中IL-1β 水平,每组另设3 个复孔,使用酶标仪在450 nm 处检测吸光度值,根据标准曲线计算相应样品中IL-1β 的含量。

1.4 统计学处理

数据使用Graphad prism6 软件进行分析,结果用(±s)表示,采用单因素方差分析、q检验和卡方检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.2 流式细胞术鉴定人PBMCs

结合CD14+抗体的人PBMCs 经磁珠提纯后,使用分选型流式细胞仪进行鉴定,得到的受试者PBMCs 纯度大于90%。见图1。

图1 CD14+人外周血单核细胞鉴定Fig 1 Flow cytometric identification of CD14+ monocytes in each group

2.3 受 试 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1的mRNA 表达情况

qRT-PCR 检测结果显示,与对照组比较,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Ⅱ组比较,Ⅲ、Ⅳ组以上指标表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Ⅲ组比较,Ⅳ组以上指标表达水平升高。见表2。

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表达情况(n=20,±s)Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3,ASC,and caspase-1 in PBMCs(n=20,±s)

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表达情况(n=20,±s)Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3,ASC,and caspase-1 in PBMCs(n=20,±s)

组别对照组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组FP NLRP3 1.000±0.067 1.913±0.108 2.711±0.212 3.514±0.127 191.458<0.000 1 ASC 1.000±0.123 1.435±0.097 1.854±0.092 2.131±0.069 77.71<0.000 1 caspase-1 1.000±0.585 1.436±0.108 2.046±0.274 2.880±0.155 32.46<0.000 1

2.3 受 试 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白的表达水平

Western blot 检测结果显示,与对照组比较,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋 白的表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Ⅱ组比较,Ⅲ、Ⅳ组以上指标表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Ⅲ组比较,Ⅳ组以上指标表达水平升高。见表3、图3。

图3 PBMCs 中NLRP3,ASC,caspase-1 蛋白的表达水平Fig 3 Expression levels of NLRP3,ASC and caspase-1 in PBMCs

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表达水平(n=20,±s)Tab 3 Expression levels of NLRP3,ASC and caspase-1 in PBMCs(n=20,±s)

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表达水平(n=20,±s)Tab 3 Expression levels of NLRP3,ASC and caspase-1 in PBMCs(n=20,±s)

组别对照组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组F P NLRP3 0.315±0.150 0.699±0.119 1.019±0.118 1.296±0.134 52.18<0.000 1 ASC 0.303±0.110 0.507±0.123 0.754±0.106 1.103±0.195 43.54<0.000 1 caspase-1 0.433±0.130 0.637±0.139 0.896±0.150 1.259±0.221 37.77<0.000 1

2.4 外周血浆中IL-1β 含量

ELISA 检测结果显示,与对照组比较,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组IL-1β 表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Ⅱ组比较,Ⅲ、Ⅳ组IL-1β 表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Ⅲ组比较,Ⅳ组IL-1β 表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 PBMCs 中IL-1β 的表达水平(n=20,±s)Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs(n=20,±s)

表4 PBMCs 中IL-1β 的表达水平(n=20,±s)Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs(n=20,±s)

组别对照组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组FP IL-1β 44.63±7.206 51.46±8.030 57.64±6.131 63.76±7.092 26.39<0.000 1

3 讨论

慢性心脏病与持续低级炎症反应相关,其促进心脏不良重塑,并与疾病进展相关[19,20]。心力衰竭是入院的最常见原因,这迫切需要增加对慢性心脏病的无菌性炎症的理解,以便为其治疗干预提供新途径。越来越多证据表明,炎症小体通过识别濒死细胞释放的危险信号,在促进无菌性炎症中发挥关键作用,而NLRP3 炎症小体可以调节慢性炎症对内在宿主信号的反应[21]。NLRP3 与接头分子“含有CARD 结构域的凋亡相关斑点样蛋白”(ASC)寡聚化,以响应危险信号,如ATP、尿酸盐和膜脂质[22,23]。NLRP3 和ASC 随后招募半胱氨酸蛋白酶pro-caspase-1 生成称为炎症小体的caspase-1 激活平台,炎症小体的激活导致31 kDa 的白介素-1β 前体水解,裂解为17 kDa 的成熟形式,参与糖尿病等一系列慢性疾病的发病机制[24-28]。

研究表明血管紧张素转化酶抑制剂、β 受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂的对射血分数低的心力衰竭患者有益[29],然而,这些患者的高死亡风险表明,神经激素的活化不能完全解释心力衰竭的发展。心力衰竭中的炎症细胞因子升高,并且它们的水平与心力衰竭的严重程度和预后相关[30],这些细胞因子被认为可以调节心肌重塑、心肌肥大和细胞凋亡、收缩力下降、纤维化增加以及其他不利的结构变化[31-33]。最初的心力衰竭研究专注于单个细胞因子,但是,要揭示心肌重塑的病理生理过程,还需要进一步研究炎症途径和细胞因子激活的潜在机制。

IL-1β 是一种促炎细胞因子,在细胞增殖、分化和 凋 亡 等 细 胞 活 动 中 发 挥 作 用[34,35]。IL-1β 诱 导 心肌细胞肌浆网钙泄漏,损害心肌收缩力[36,37]。IL-1β刺激一氧化氮的产生,循环诱导型一氧化氮合酶相应增加,导致心肌细胞凋亡和组织重塑[38]。IL-1β 在心力衰竭时升高,并与运动耐量差和缺血-再灌注损伤后的重构有关[39,40]。调节IL-1β 可减轻心肌增大和心室功能障碍。本研究发现Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清IL-1β 水平高于对照组(P<0.05),Ⅲ组血清IL-1β水平高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅳ组血清IL-1β 水平高于Ⅲ组(P<0.05),该结果提示IL-1β 可能参与了心力衰竭的发生发展。

本研究通过提取患者PBMCs 并检测NLRP3、ASC 及Caspase-1 信号通路的表达情况发现,与正常组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组患者外周血NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 和蛋白质含量均升高(P<0.05)。结合患者血清炎症产物IL-1β 的结果可以得出结论,慢性心力衰竭的发生和发展可能与NLRP3-ASC-Caspase-1 信号通路诱导的炎症活化有关。

总而言之,本研究发现慢性心力衰竭患者PBMCs 中NLRP3-ASC-Caspase-1 信号通路相关物质表达明显升高并伴有炎症活化,此外随心力衰竭级别的加重其水平升高更加显著。但不足之处是,本研究样本量较小,存在一定的局限性,此外实验未对PBMCs 中相关信号通路采取干预措施从而验证通路诱导的炎症在心力衰竭中的具体作用。因此下一步可能需要设计前瞻性及动物实验进行探究进一步确认NLRP3 通路作用于慢性心力衰竭的具体机制。

作者贡献度说明:

朱飞宇:进行实验,整理数据,撰写论文。王洪巨、康品方:对论文内容作出关键修正。徐庆梅:参与实验设计。朱建、汤阳、高琴、唐碧:给与实验思路指导。

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