垫状卷柏提取物不同极性部位对人白血病细胞K562增殖抑制作用的研究

河南省许昌市中心医院（461000）张应

垫状卷柏是卷柏科卷柏属植物，在我国有广泛的分布和使用，具有活血通经、化癖止血的功效[1]。近年来药理学研究表明垫状卷柏具有多种药理学活性，其中抗肿瘤活性具有特异性得到关注和重视[2][3]。本课题组前期对垫状卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP)的抗肿瘤活性进行系统性的筛选，发现SP对人白血病细胞系K562有较强的增殖抑制作用，且其增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的，但同时也注意到SP的体外抗肿瘤活性不是很强，故笔者开展SP不同极性部位对K562肿瘤细胞活性的进一步研究。汇报如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及药材 人慢性髓系白血病细胞系（K562）购于中国科学院基础医学研究院细胞库。垫状卷柏购于安徽亳州滕王药业有限公司，批号为1907003，为全草干燥状态。

1.2 试剂 RPMI-1640培养液、灭菌胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购于Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇购于国药化试。

1.3 仪器 超声波清洗仪（KQ-500，昆山市超声仪器有限公司）；HERACELL 150i型CO2细胞培养箱（Thermofisher公司）；生物安全柜（美国LABCONCO公司）；CKX41型倒置光学显微镜（Olympus公司）；全自动酶标仪（Thermo）；Anke TDL-40型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-60L型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KB，安海申安医疗器械厂）。

1.4 SP不同极性部位的制备 取垫状卷柏干燥全草，粉碎过40目筛备用。称取10kg状卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作为提取溶剂（料液比1∶20），浸提24h后，加热回流提取1h，真空抽滤后滤渣重复上操作2次，最后合并滤液，旋蒸浓缩后并减压干燥，共得589g（得率为5.89%）。取垫状卷柏提取物500g用适量纯化水混悬后，采用不同极性溶剂进行依次萃取，依次为：石油醚、乙酸乙酯、正丁醇。减压浓缩干燥后分别得到SP不同极性部位粉末或浸膏，石油醚极性部位4.2g（得率为0.049%），乙酸乙酯极性部位60.2g（得率为0.709%），正丁醇极性部位110.7g（得率为3.185%）；剩余的水液减压浓缩干燥，得到水层极性部位270.4g（得率为3.185%）。

1.5 样品溶液的制备 实验临用前用DMSO溶解得到高浓度的母液，0.22μm滤膜过除滤后待用，给药时用PBS溶液稀释至所需的浓度。最高给药浓度组所用的药液中DMSO浓度均小于0.3%，预实验表明含0.3%DMSO的PBS组与PBS空白组相比较，对本研究所涉及肿瘤细胞株的吸光度均无显著性差异（P>0.05），说明含0.3%DMSO的PBS对本研究中所有肿瘤细胞株的增殖无影响。

1.6 SP不同极性部位对肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性检测取对数生长期的人慢性髓系K562肿瘤细胞，脱壁重悬后，以6×104个/mL浓度接种于96孔板中，每孔100μL，移入CO2细胞培养箱培养24h后，吸弃原培养液，加入RPMI1640培养液90μL，再加入10μL不同浓度的SP不同极性部位溶液，每个药物浓度设置平行6个复孔，上下为本底对照，并另设PBS作为空白对照组。最后移入CO2细胞培养箱再培养，48h后吸弃培养液，加入0.5mg/mL MTT溶液10μL培养4h后弃MTT溶液，每孔加DMSO150μL，在微量振荡仪避光振荡10min，用酶标仪检测490nm波长处的吸光度（A值）。细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A值/空白对照组A值）×100%。药物半数抑制浓度IC50用SPSS16.0软件进行计算。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0软件统计分析。组间计量数据比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SP不同极性部位对多种肿瘤细胞株增殖的影响 MTT结果显示，与PBS空白对照组相比，在设定实验浓度下SP水层部位对细胞增殖抑制率未发现有明显差异(P＞0.05)，说明SP水层部位在设定的浓度下对K562肿瘤细胞株的增殖无影响；与PBS空白对照组相比，SP石油醚部位(10μg/mL～250μg/mL浓度范围内)、SP乙酸乙酯部位(5μg/mL～250μg/mL浓度范围内)和SP正辛醇部位(25μg/mL～250μg/mL浓度范围内)对K562肿瘤细胞株均有明显增殖抑制作用(P＜0.05)，且抑制效应呈明显的浓度依赖性，如附图所示。

附图 不同浓度SP极性部位对各系肿瘤细胞增殖作用的影响(±s,n=6)

2.2 SP不同极性部位对多种肿瘤细胞株增殖抑制的IC50SP不同极性部位对K562肿瘤细胞株的IC50通过SPSS16.0软件计算，SP水层部位无细胞增殖活性无法计算；SP石油醚部位、SP乙酸乙酯部位和SP正辛醇部位分别为45.7μg/mL、16.1μg/mL和159.8μg/mL，其中SP乙酸乙酯部位的IC50远小于其他极性部位的IC50，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

卷柏属植物作为民间传统草药被用于肿瘤方面的治疗，其中卷柏属植物中的垫状卷柏被中国药典收录，主治经闭痛经、损伤跌等症，其成分较为复杂，主要有双黄酮类、炔酚类、苯丙素类、生物碱类等[4][5]。

本课题组前期对SP在不同系列肿瘤细胞系的增殖活性进行筛选，发现对人白血病细胞系K562的敏感性最高且作为机制是诱导细胞凋亡，但IC50均较高约在200μg/mL；笔者对SP通过萃取得到不同极性部位，发现SP乙酸乙酯部位活性最高，IC50仅为SP的1/10。但SP乙酸乙酯部位其中化学成分也较为复杂，有些化合物可能并不具有抗肿瘤活性，甚至可能抑制抗肿瘤活性。这些都十分值得进一步的深入研究，这也是本课题组下一步的主要研究方向。

综上所述，SP乙酸乙酯部位对K562肿瘤细胞有较高的增殖抑制活性，其中可能发挥抗肿瘤活性的主要成分及相应机制需进一步的研究。