一株产蛋白酶粘质沙雷氏菌的分子鉴定与发酵条件优化

张 利，卢利平，，丁功涛，杨舜铨，蔡新东，丁海娥

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心中国-马来西亚联合实验室，甘肃兰州 730030）

蛋白酶是一类催化蛋白质水解的酶类[1]，其作用是将肽链间的肽键水解，从而达到降解蛋白质的目的。根据蛋白酶降解蛋白质这一特性，使得蛋白酶制品在饲料、食品、药品、洗涤剂、皮革、化妆品等领域有较广泛应用，蛋白酶占工业酶市场将近60%[2-3]。在饲料方面，蛋白酶能够降解饲料的抗营养分子，维持肠道的微生态平衡，提高蛋白质消化利用率，提高动物肠道的消化能力[4-5]，促进肠道健康[6]。于书坤[7]研究发现，偏碱性蛋白酶不仅能提高饲料中蛋白质的利用率，也能提高饲料中淀粉、脂肪、纤维等结构碳水化合物的利用率，同时偏碱性蛋白酶能与内源蛋白酶和其他饲料酶发生互补作用促进动物肠道的吸收。在食品方面，木瓜蛋白酶可作为肉类润滑剂、啤酒品质改良剂、饼干松化剂、调味品、保健品等[8]。在药品方面，蛋白酶具有抗肿瘤和抗血栓、促进伤口愈合、外科消毒剂等作用[9]。由此可见，筛选产蛋白酶的菌株具有重要的意义。

近年来，在产蛋白酶菌株及其发酵条件等方面做出了很多方面的研究。王永红等人[10]利用牛奶、豆浆作为选择性培养基，从土壤、水体等自然环境及家禽内脏中筛选出2 株具有高效水解菜粕蛋白产氨基酸的短小芽胞杆菌。刘静等人[11]从垃圾场淤泥、食堂排污水沟含蛋白量较高的土壤中筛选分离得到的菌株发酵产生的酶活为2.03 U/mL。陈茏等人[12]从南昌大学食堂污水中筛选出一株高产蛋白酶解淀粉芽孢杆菌。目前，关于粘质沙雷氏菌进行发酵产酶的研究报道很少，大多数对粘质沙雷氏菌的研究都在其他方面。李鑫等人[13]利用天然存在的粘质沙雷氏菌Hal 为研究害虫防治的试验材料，发现颗粒剂喷灌法能有效防除杂草。骆纵纵等人[14]从土壤中筛选出一株对重金属具有耐性的粘质沙雷氏菌，采用控制变量法对该菌去除镉进行了研究，发现当Cd 质量浓度为3 mg/L，加菌量为4%，pH 值为9.4，菌龄为 4.5 h及处理时间为96 h 时，粘质沙雷氏菌对Cd 的去除效果最高可达到91.00%。王俊峰[15]在研究沙雷氏菌降解氟苯虫酰胺过程中，发现粘质沙雷氏菌对氟苯虫酰胺具有最高降解能力，48 h 降解率达到 52.6%。张平等人[16]在研究粘质沙雷氏菌对榛实象甲中肠细菌多样性的影响，发现粘质沙雷氏菌能够改变榛实象甲成虫中肠细菌群落结构。对粘质沙雷氏菌产酶方面的研究报道较少，梅建凤等人[17]从家蚕蛹的肠道中分离出一株产舍肽酶的粘质沙雷氏菌LL-413 菌株，发酵产酶活力达到1 126 U/mL。耿芳等人[18]从海南土壤中筛选出一株高产蛋白酶的粘质沙雷氏菌，蛋白酶活力可达到126 U/mL，经过优化发酵酶活力可达到1 932.3 U/mL。

为筛选出一株产蛋白酶的菌株，试验以甘肃省兰州市榆中县崖湾奶牛场的牛粪便为筛选样品，采用酪素培养基筛选出一株产蛋白酶菌株2021-9，通过革兰氏染色、生理生化试验、16S rDNA 序列测定予以鉴定，并对其生长条件和发酵条件进行研究，以期为该菌株产蛋白酶的产酶条件研究及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

粪便样品来自榆中县崖湾奶牛场，粪便样品中筛选得到一株产酶量较高的粘质沙雷氏菌。

1.1.2 培养基

①牛肉汤培养基：0.5%牛肉膏，1%可溶性淀粉，0.5%NaCI，pH 值 7.2~7.4，121 ℃下灭菌 20 min。②酪素培养基：0.4%干酪素，0.107%Na2HPO4·7H2O，0.036%KH2PO4，1.8%琼脂，121 ℃下灭菌 20 min。③基础培养基：0.3%葡萄糖，2%胰蛋白胨，0.5%NaCl。④基础发酵培养基：5%豆粕，4%蔗糖，3.2%麸皮，0.03%KH2PO4，0.4%Na2HPO4·12H2O，121 ℃下灭菌20 min。

1.1.3 试剂

生化试剂盒，杭州微生物试剂有限公司提供；牛肉膏、可溶性淀粉、NaCI、干酪素、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、琼脂、L - 酪氨酸、蔗糖、玉米粉、葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉，索莱宝生物科技有限公司提供；豆粕、麸皮、黄豆粉，北京鸿润宝顺科技有限公司提供。

1.1.4 仪器及设备

YXQ-LS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司产品；DHG-9146A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；AR224CN 型电子天平，奥豪斯仪器常州有限公司产品；Pico17 型高速离心机，热电发光二级管有限公司产品；GENESYS 10S 型紫外可见分光光度计，美国Thermo 公司产品；L9 型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；SW-CJ-1CU 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；SG2-FK 型便携式pH 计；HH-S4A 型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化

称取2.5 g 牛粪样品，进行剪碎处理后接种至100 mL 牛肉汤培养基中，于37 ℃，180 r/min 条件下富集培养24 h。用生理盐水梯度稀释至1×10-4，1×10-5，1×10-6，在酪素培养基上进行平板涂布，将涂布好的平板置于37 ℃恒温培养箱中培养2 d，筛选出具有透明水解圈的菌落，记录菌落的形态、颜色、大小及水解圈大小等。将出现水解圈的菌落在酪素培养基上进行3~4 次平板划线，确定为单一菌落后于25%的甘油，-80 ℃下保存。将筛选的菌株于酪素培养基进行复筛，测量透明圈直径（H） 和菌落直径（C），比较各个菌株H/C 值大小，将H/C值较大的、形态颜色较特殊的菌株作为目标菌株。

1.2.2 菌种鉴定

选择上述步骤纯化后水解圈大的、形态颜色较特殊的编号为2021-9 的菌株作为目标菌株。根据目标菌株的形态观察、生理生化特征、16S rDNA 序列测序进行菌种鉴定。将初筛得到的菌株在酪素培养基上划线得到单一菌落，记录菌落的大小、颜色、形状、质地等。挑取单一菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察染色结果。根据生理生化试剂盒说明书将处于对数生长期的菌液分别接入生化试剂管，37 ℃下培养24 h，记录菌株的生理生化特征。将菌液委托北京六合华大基因科技股份有限公司利用通用测序引物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 对 菌 株进行16S rDNA 序列进行扩增和测定。将序列结果在NCBI-BLAST 中进行比对，利用MEGA 7.0 软件构建进化树，确定该菌株种类。

1.2.3 菌株的生长曲线绘制

将已处于对数生长期的菌液接种至新的牛肉汤培养基中，在37 ℃，180 r/min 条件下进行摇床培养，每隔2 h 进行吸光度测定，利用Origin 9.0 软件进行生长曲线的绘制。

1.2.4 菌株生长条件的研究

将保存在-80 ℃的菌株迅速解冻，接种在牛肉汤培养基中，于转速180 r/min，温度37 ℃的条件下培养 24 h，每隔2 h 测定A600，用吸光度值表示菌株生长情况。

（1） 不同碳源对菌株生长的影响。在2%胰蛋白胨，0.5%NaCl 中分别加入0.3%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉作为碳源，接种量0.1%，以不加菌株的培养基作为空白对照，于温度37 ℃，转速180 r/min 条件下培养12 h 后测定A600。

（2） 不同氮源对菌株生长的影响。在0.3%蔗糖，0.5%NaCl 中分别加入2%的胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素作为氮源，接种量0.1%，以不加菌株的培养基作为空白对照，于温度37 ℃，转速180 r/min 条件下培养12 h 后测定A600。

（3） 不同温度对菌株生长的影响。选择0.3%蔗糖、2%酵母粉分别作为碳源、氮源，接种量0.1%，以不加菌株的培养基作为空白对照，于温度33，35，37，39，41 ℃，转速180 r/min 的条件下培养12 h后测定A600。

（4） 不同pH 值对菌株生长的影响。选择0.3%蔗糖、2%酵母粉分别作为碳源、氮源，以培养基自然pH 值为基础，调节pH 值分别为4.7，5.7，6.7，7.7，8.7，接种量0.1%，以不加菌株的培养基作为空白对照，于温度39 ℃，转速180 r/min 的条件下培养 12 h 后测定 A600。

1.2.5 不同培养基对菌株产酶能力的影响

将处于对数生长期的菌液按5%的接种量接种到发酵培养基中，37 ℃下培养48 h，利用福林酚法测定其酶活。试验根据培养基对产蛋白酶活的影响，设定6 组培养基，培养基组成及编号。

不同培养基编号及其成分见表1。

表1 不同培养基编号及其成分

1.2.6 不同发酵培养基产酶活力测定

（1） 酪氨酸标准曲线的绘制。参照国标GB/T-23527-2009 蛋白酶制剂[19]绘制酪氨酸标准曲线，利用Excel 2010 软件进行数据统计及处理，利用Origin 9.0 绘图。

（2） 酶活测定。将发酵液置于4 ℃条件下，以转速5 000 r/min 离心10 min 获得粗酶液，利用福林酚法进行酶活力测定。

1.3 数据处理

测定结果使用Excel 2010 软件进行数据统计，采用SPSS 22.0 软件对试验数据进行处理，Origin 9.0作图，数据结果以平均值X±SD 表示。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

试验得到9 株能在酪素培养基上产生透明水解圈的菌株，挑选了其中1 株H/C 值大的作为试验的目标菌株（图1），H/C 值为5.45，在酪素培养基上菌落呈现淡红色、较大、呈圆形，光滑湿润。菌株编号为2021-9，以做进一步研究。

菌株2021-9 透明圈见图1。

图1 菌株2021-9 透明圈

2.2 菌种鉴定

利用透明圈法从牛粪样品中筛选出产蛋白酶的菌株2021-9。革兰氏染色后发现为革兰氏阴性菌，菌株为杆状（图2）。对菌株进行吲哚试验、糖类发酵试验、枸盐酸试验等生理生化特性测定。根据该菌株的形态和生理特征，确定该菌株属于Serratia 属。

菌株 2021-9 革兰氏染色结果见图 2，菌株2021-9 的主要生理生化特性见表2。

表2 菌株2021-9 的主要生理生化特性

图2 菌株2021-9 革兰氏染色结果

利用通用引物27F 和1492R 扩增菌株2021-9 的16S rDNA 序列用于测序分析，结果显示该菌株的16S rDNA 核酸序列长度为1 500 bp，将此序列与NCBI 的数据库中序列进行Blast 分析比对，显示与Serratia marcescens 亲缘关系最近，同源性为100%，因此可确定该菌株为粘质沙雷氏菌。利用Mega 7.0软件构建16S rDNA 基因全序列为基础的Neighbor-Joining 系统进化树。

基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系统进化树见图3。

图3 基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系统进化树

2.3 菌株生长曲线

菌株2021-9 生长曲线见图4。

由图4 可知，该菌株的对数生长期为14 h 左右，在4~14 h 期间，菌株生长迅速；14~18 h 时，菌株生长较为缓慢；在14 h 以后，菌株生长呈平缓衰退趋势生长，因此菌株数量最多的时期为14 h。

2.4 不同生长条件对菌株生长的影响

2.4.1 不同碳源对菌株生长的影响

探究碳源对菌株生长的影响，设定的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉，图5 为根据原液测得的吸光度稀释5 倍后的结果。以蔗糖作为碳源时，菌株生长情况达到最佳，同时也发现以葡萄糖、麦芽糖、乳糖为碳源时，菌株的生长情况较为良好，可以明显看出淀粉不宜作为该培养菌株生长的碳源。因为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖都是单糖或者二糖，淀粉是多聚糖，相比多聚糖，菌株可能更容易直接利用单糖或者二糖，所以淀粉明显不是适宜该菌株生长所需要的碳源。

碳源对菌株2021-9 生长的影响见图5。

图5 碳源对菌株2021-9 生长的影响

2.4.2 不同氮源对菌株生长的影响

在对该菌株进行最适碳源研究后，在以蔗糖作为碳源的基础上，探究氮源对菌株生长的影响，设定的氮源有胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素。图6 为根据原液测得的吸光度值稀释5 倍后的结果。以酵母粉作为氮源时，该菌液的吸光度值最高，菌株生长情况最佳，而以干酪素作为该菌株生长的氮源时吸光度值最低，因此酵母粉是该菌株最适宜生长所需的氮源。干酪素的主要成分是酪蛋白[20]，相比于以上几种作为氮源时，酪蛋白含量相对较多，可能是由于该菌株对酪蛋白的利用率低，因此干酪素是不适宜菌株2021-9 生长。

氮源对菌株2021-9 生长的影响见图6。

图6 氮源对菌株2021-9 生长的影响

2.4.3 不同温度对菌株生长的影响

在探究该菌株最适生长的碳源、氮源分别为蔗糖、酵母粉的基础上，设定5 个温度梯度探究温度对菌株生长的影响。图7 为根据原液测得的吸光度值稀释6 倍后的结果。该菌株最适生长的温度条件为39 ℃，最不适宜该菌株生长的温度条件为41 ℃。菌株2021-9 在低于41 ℃的情况下生长都较为良好，而在以41 ℃为培养条件时，菌液的吸光度值明显低于以其他温度培养的菌液，说明该菌株可能适宜较低温度环境下生长。

温度对菌株2021-9 生长的影响见图7。

图7 温度对菌株2021-9 生长的影响

2.4.4 不同pH 值对菌株生长的影响

在探究该菌株最适生长的碳源、氮源、温度分别为蔗糖、酵母粉、39 ℃的基础上，根据原培养基自然pH 值设定5 个pH 值梯度。图8 为根据原液测得的吸光度值稀释5 倍后的结果。该菌株最适生长的pH 值是8.7，同时pH 值为4.7~7.7 时也适合该菌株的生长，说明适宜菌株2021-9 生长的pH 值范围比较广。

pH 值对菌株2021-9 生长的影响见图8。

图8 pH值对菌株2021-9 生长的影响

2.5 培养基对该菌株产酶的影响

2.5.1 酪氨酸标准曲线

酪氨酸标准曲线见图9。

图9 酪氨酸标准曲线

2.5.2 不同培养基对菌株发酵产酶的影响

以基础发酵培养基为基础，设定了其他发酵培养基，培养基编号分别为A，B，C，D，E，F。由图10 可知，F 号培养基产酶活力达到最大，最大酶活为29.834 U/mL，培养基A，B，E 发酵也有较大酶活。因此，最适宜该菌株发酵的培养基组成为3.2%麸皮，3%黄豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4。

不同培养基对2021-9 菌株发酵产酶的影响见图10。

图10 不同培养基对2021-9 菌株发酵产酶的影响

3 结论

从甘肃省兰州市榆中县崖湾奶牛场的牛粪中筛选出一株能够产蛋白酶的菌株，编号为2021-9，经革兰氏染色、生理生化鉴定、16S rDNA 鉴定为粘质沙雷氏菌。粘质沙雷氏菌又称为灵杆菌，广泛存在于水、空气、土壤、食品中，产生一种红色的非扩散性色素——灵菌红素[21-22]，灵菌红素是微生物的次级代谢产物，是一种天然红色素，具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫制剂等重要活性，在医药、环境、染料等方面具有重要应用[23-24]。在灵菌红素方面有多种研究，如李颖等人[25]从土壤中筛选出一株产灵菌红素的粘质沙雷氏菌PG12，确定菌株发酵合成灵菌红素的条件26 ℃，pH 值7.5，发酵14 h后灵菌红素量可达到最大值1 212.7 mg/L。Nguyen Van Bon 等人[26]以粘质沙雷氏菌TNU02 为发酵菌体，脱矿蟹壳粉为原料低成本生产灵菌红素。试验以牛肉汤为培养基，180 r/min，37 ℃的条件对2021-9 菌株进行培养，发现在培养6 h 后该菌株达到最大生长浓度，即为对数生长期。在以基础培养基培养该菌株的前提下，探究碳源、氮源、温度、pH 值对该菌株生长的影响，发现最适该菌株生长的培养基组成及条件为0.3%蔗糖，2%酵母粉，0.5% NaCl，pH 值8.7，温度37 ℃。设定6 种培养基对其进行发酵培养，得到最优培养基为3.2%麸皮，3%黄豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4，最大酶活可达29.834 U/mL。因此，后续工作可针对发酵培养基成分和发酵条件进行优化，为进一步提高酶活提供一定的研究基础。