绞股蓝皂苷调控长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡对ApoE-/-AS小鼠肝脏脂质沉积的影响及机制研究

宋 囡，曹慧敏，陈 丝，王 莹，王 杰，王 群，贾连群*，杨关林*

1辽宁中医药大学 中医药创新工程技术中心 脏象理论及应用教育部重点实验室；2辽宁中医药大学，沈阳 110847

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病前期的主要病理基础,肝脏是AS及其相关疾病启动和发展中最易受损的器官之一，其脂质沉积水平直接或间接反应动脉内膜脂质沉积情况，可作为预测AS水平的指标[1]。人类基因组中大部分为非编码区，转录产生非编码RNA(ncRNA)，微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)是ncRNA的两个重要分类。其中，LncRNA通过多种机制在不同水平进行基因表达调控，发挥其生物学功能。近年来，miRNA和LncRNA在疾病发生发展中相互作用的分子机制引起了人们的注意[2]。长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulates gene 1，TUG1)是一种进化上高度保守的长链非编码RNA。有研究发现TUG1与食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌症的发生发展有关[3]，但是其与肝脏脂质沉积及动脉粥样硬化的关系，研究尚少。有研究发现干扰长链非编码RNA TUG1可通过上调miR-26a缓解LPS诱导的线粒体损伤、细胞凋亡和炎症反应[4]。

绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum，GP)是绞股蓝属(Gynostemma)的多年生草本藤本植物。其名最早见于明代的《救荒本草》。其具益气健脾，化痰止咳，清热解毒的功效。曾被科技部“星火计划”列为待开发的“珍贵中草药”，在2002年被卫生部列入保健品清单。自20世纪70年代以来，人们已经系统地研究了绞股蓝的化学成分及药理学作用。研究发现其主要药用成分是绞股蓝皂苷(gypenoside，GPs)。GPs通过降脂，抗血小板聚集和抗血栓形成发挥抗AS作用[5,6]。课题组前期采用ox-LDL诱导的血管内皮细胞出现线粒体膜电位损伤及呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性下降，并且明确了GP的有效成分GPs、绞股蓝皂苷XILX、人参皂苷GRb3可以通过提高线粒体膜电位；影响线粒体能量代谢相关蛋白；上调ox-LDL诱导内皮细胞的自噬效应，降低内皮细胞损伤，发挥对ox-LDL诱导的内皮细胞的保护作用[7-9]。在前期研究的基础上，本文重点关注GPs是否通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝脏脂质沉积，进而防治AS。

1 材料

1.1 动物饲养及分组给药

20只健康ApoE-/-小鼠，10只C57BL/6J小鼠，体重20±2 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，SPF级，环境温度为22±1 ℃，湿度50%±5%，自然光照，正常饲料喂饲，自由饮食饮水，适应性喂养7 d后，将20只健康ApoE-/-小鼠随机分为2组：模型组、绞股蓝皂苷组，每组10只。给予高脂饲料喂饲，每日给予高脂饲料：脂肪供能比为41%的高脂纯化饲料，通常称为“西方饮食”饲料，额外添加0.15%胆固醇，喂饲12周。造模12周后，绞股蓝皂苷组按照2.973 mg/kg/d灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，灌胃4周。

1.2 试剂、药物与仪器

胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(四川迈新生物技术有限公司)；HE染色液(北京索莱宝科技有限公司)；一抗稀释液(上海碧云天生物技术研究所)，Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP及GAPDH抗体(proteintech，中国)；绞股蓝皂苷(西安天丰生物科技有限公司)；动物组织RNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；全自动生化分析仪(日本东芝)，7500Real Time PCR仪(美国Applied Biosystems)，Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统及配套试剂(ProteinSimple,San Jose，CA，USA)。

2 方法

2.1 动物处置

取材实验前禁止进食12 h，不禁水，称体重，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血约5～10 mL，静置1～2 h，3 000 rpm离心30 min，分离血清，取上清液，低温(4 ℃)保存。取小鼠肝组织并切成小块，分别4%多聚甲醛固定及冷冻。

2.2 血脂检测

按生化试剂盒说明书采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.3 HE染色观察肝脏组织病理形态

将肝脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按苏木素-伊红(HE)染色常规方法进行。70%～100%梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋、切片(切片厚度5 μm)、贴片、烤片后，用二甲苯脱蜡、70%～100%梯度酒精复水、苏木精染色、70%盐酸酒精分色、伊红复染后，再用70%～100%梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片石蜡包埋，光学显微镜下观察小鼠肝脏组织形态。

2.4 实时荧光定量qPCR检测长链非编码TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表达

Trizol处理各组肝脏组织，提取总RNA，逆转录成cDNA，设定PCR反应条件，用SYBR Green Mater Mix试剂检测待测基因的mRNA及miRNA水平(引物序列见表1)，共重复检测3次。用ΔΔCT法对RT-PCR结果进行相对定量分析。ΔCT值为目的基因CT值与管家基因(GAPDH，U6)CT值的差值，ΔΔCT为各实验组ΔCT与空白对照组ΔCT的差值。平均相对含量=2-ΔΔCT，为相对于正常组mRNA及miRNA水平。

表1 引物序列

2.5 Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP 蛋白表达

打开Wes、电脑和Compass软件，进行硬件自检。利用RIPA蛋白裂解液(含PMSF)提肝脏组织蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，使用Antibody Diluent II按1∶50比例稀释一抗，每个样品上样量为4.5 μL(包括5×Master Mix 0.9 μL，样品原液与0.1×Sample Buffer合为3.6 μL，95 ℃变性5 min)。样品制备后，分别按照样品、封闭液、一抗、二抗、发光液及清洗缓冲液的顺序加入板内，排板布局，点击start进行检测，检查结束后分析结果。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 绞股蓝皂苷对ApoE-/-AS小鼠血脂水平的影响

与正常对照组相比，模型ApoE-/-小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均显著升高，HDL-C水平显著下降(P<0.01)；与模型组相比，绞股蓝皂苷组血清中TG、TC、LDL-C水平均发生显著性降低(P<0.01)，HDL-C水平无明显变化趋势(见表2)。

表2 各组小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的比较

3.2 绞股蓝皂苷对ApoE-/- AS小鼠肝脏病理形态的改变

正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞为圆形，细胞核居中，胞浆内未见脂滴，排列方式为条索状且肝窦不狭窄；模型组肝细胞体积变大，胞浆内可见大量的脂肪空泡，且大小不等，肝窦狭窄或消失；绞股蓝皂苷组较模型组有所变化，其肝细胞脂肪变性程度减轻，脂肪空泡明显减少，肝窦狭窄有所减轻(见图1)。

图1 小鼠肝脏病理形态学改变结果(200×)Fig.1 Results of pathological morphological changes of mouse liver (200×) 注：A：正常组；B：模型组；C：绞股蓝皂苷组Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group

3.3 绞股蓝皂苷对ApoE-/-AS小鼠肝脏长链非编码TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA表达的影响

与正常组相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝脏Lnc-TUG1表达显著升高，miRNA-26a显著下降(P<0.01)；与模型组相比，绞股蓝皂苷肝脏Lnc-TUG1表达有所下降，miRNA-26a表达有所上调(P<0.05)；与正常对照组相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝脏Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved PARP mRNA表达显著升高，cleaved caspase-9 mRNA仅有上升趋势，Bcl2 mRNA显著下降(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比，绞股蓝皂苷小鼠肝脏Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 mRNA表达显著下调，cleaved PARP mRNA仅有下调趋势，Bcl2 mRNA显著上调(P<0.01或P<0.05,见图2)。

图2 各组小鼠肝脏Lnc TUG1、miRNA-26a及Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP mRNA的表达(n=3)Fig.2 The expression of Lnc TUG1,miRNA-26a and Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP mRNA in the liver of each group of mice (n=3)注：A：正常组；B：模型组；C：绞股蓝皂苷组。与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01，下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Gypenoside group.Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.The same below.

3.4 绞股蓝皂苷对ApoE-/-AS小鼠肝脏Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白影响

与正常对照组相比，模型ApoE-/-AS小鼠肝脏Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达显著升高，Bcl2蛋白显著下降(P<0.01或P<0.05)；与模型组相比，绞股蓝皂苷小鼠肝脏Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达显著下调，Bcl2蛋白显著上调(P<0.01或P<0.05)(见图3)。

图3 各组小鼠肝脏Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP蛋白表达(n=3)Fig.3 The expression of Bcl2,Bax,Cytc,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9 and cleaved PARP protein in the liver of each group of mice (n=3)

4 讨论与结论

随着人们生活水平显著提高，饮食结构也有所改变，在高胆固醇饮食与高强度工作压力等因素下，心血管疾病的发病率逐渐增高，AS为心血管疾病最主要的死亡因素，对其防治具有重要的意义。GP系葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物。绞股蓝全草入药，性凉，味苦、微甘，归肺、脾、肾经，具有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效[10]。GPs是从GP中提取的有效成分群，含有80余种人参皂苷类成分，所有GPs的苷元部分都为达玛烷型四环三萜类，对治疗和预防AS等心血管疾病有显著功效[11,12]。

长链非编码核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid，LncRNA)是一类长度超过200 nt的功能性RNA分子，不具有蛋白编码功能，早期被认为是RNA转录过程中的“噪音”[13]。但近年来的研究发现，LncRNA参与人类多种疾病的发生、发展[14]。值得重视的是LncRNA也在心血管疾病中存在差异表达，并且通过不同的作用机制在心血管疾病的调控网络中发挥作用，参与心血管疾病的发生发展。前期研究已明确miRNA通过与靶mRNA上的互补序列结合来抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解[15]，而LncRNA可以作为miRNA海绵与miRNA相互作用[16]来影响mRNA进而调控基因表达。研究发现在缺氧/复氧条件下，LncRNA AK088388通过作为miR-30a的内源性RNA海绵来调节心肌细胞的自噬[17]。LncRNA Mexis是依赖于LXR转录的ATP结合盒转运体A1(ABCA1)基因的扩增器，而ABCA1蛋白可将动脉血管壁细胞内的胆固醇泵出细胞，对高密度脂蛋白(HDL)的形成和胆固醇外流的调节至关重要[18]。可见，LncRNA参与脂质代谢影响AS发生发展机制研究不容忽视。TUG1是一种进化上高度保守的长链非编码RNA，目前研究明确TUG1不仅与食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等癌症的发生发展极为密切，LncRNA TUG1与miR-138-5p相互影响可能参与慢性心力衰竭的发病发展[19,20]，并且可通过上调miR-26a缓解LPS诱导的线粒体损伤、细胞凋亡。研究发现miRNA-26在心血管疾病中发挥重要作用，其在心脏疾病中表达下调，miRNA-26在心肌肥大中起关键作用，大鼠模型和心肌细胞中miRNA-26a/b表达均下调[21]。课题组前期研究发现，线粒体凋亡途径在AS发生发展过程中发挥着重要的作用，并且在此过程中，GPs具有调节作用。根据ApoE-/-小鼠在高脂喂饲12周可出现典型的AS病理特征，本文选用AS经典模型(ApoE-/-的C57BL/6J小鼠)作为主要研究对象，以C57BL/6J小鼠作为正常对照[22]，重点关注GPs是否通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝脏脂质沉积，进而防治AS。

研究发现GPs可以改善ApoE-/-AS小鼠血脂水平及肝脏脂质沉积情况，结果与前期研究一致。在此基础上，首先发现ApoE-/-AS小鼠肝脏长链非编码RNA TUG1明显上调，而miR-26a显著下调，经GPs干预后，上述情况出现反向结果。而线粒体凋亡途径相关指标也同时发生变化，ApoE-/-AS小鼠肝脏Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达趋势基本一致，在模型组中Bcl2 mRNA及蛋白表达显著下调，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达出现上调，GPs干预后，Bcl2 mRNA及蛋白表达有所上调，Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达有所下调。线粒体是细胞有氧呼吸的主要基地和供应能量的重要场所，在细胞凋亡的发生中发挥着重要的作用。线粒体是细胞凋亡的关键调节器，作为细胞的能量工厂，参与氧化磷酸化和ATP的生成，同时线粒体功能障碍也将会导致ATP合成受损。内源性线粒体途径是细胞凋亡主要途径之一，Cytc是线粒体内包含的与细胞凋亡存在密切关系的物质。在凋亡信号的刺激下，线粒体膜的通透性处于开发状态，Cytc的释放以及caspase的激活进而发生线粒体凋亡[23,24]。可见，Cytc由线粒体释放至胞浆是引发线粒体凋亡途径发生的关键步骤，Cytc释放是在细胞凋亡早期发生的重要事件，具体环节为通过线粒体MPTP或Bcl-2家族成员调控的MOMP释放到细胞质中，接下来释放到细胞质中的Cytc进一步被利用，可在ATP/dATP存在的情况下，与caspase-9结合形成凋亡复合物，继而活化caspase-9，活化后的caspase-9又可激活caspase-3，进一步启动caspase级联反应而导致细胞凋亡[25,26]。Caspase是一类酶原，正常状态下是以无活性的结构存在的，caspase依赖的线粒体通路中，Cytc从线粒体释放后与ATP，Apaf-1联合构成多聚体，同时caspase-9和它结合构成凋亡体，可水解caspase-9酶原而激活caspase-9，激活的caspase-9又可以进一步激活caspase-3，活化的caspase-3可切割DNA修复酶PARP，使PARP被剪切为小片段，不能发挥其正常功能，进而导致DNA裂解，最终引起细胞凋亡[27,28]。综上结果说明，GPs可能通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE-/-AS小鼠肝脏脂质沉积，进而防治AS，其干扰机制可能与调控线粒体凋亡的Bcl2、Bax、Cytc、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及cleaved PARP表达水平有关。然而，其具体靶向调控关系，有待后续细胞实验深入验证，此研究有望为中药防治疾病的网络靶标分析、中药多成分多靶点复杂机制解析等研究奠定基础，为中西医结合防治心血管疾病及临床应用提供更有力的实验依据。