纸莎草的化学成分研究

段文兰，娄嘉豪，王 蔷，赵紫艳，赖 祺，裴少非，曾广智，尹俊林

云南民族大学民族医药学院 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室;云南省高校天然源抗癌药物靶向递送研发重点实验室，昆明 650500

纸莎草(Cyperuspapyrus)为莎草科(Cyperaceae)莎草属(Cyperus)植物，是一种高大的水生或水湿生植物。纸莎草又称纸草、埃及莎草或埃及纸草，原生于欧洲南部、非洲北部以及小亚细亚地区，是构成较深水中植被的主要植物。纸莎草是古埃及文明的一个重要组成部分，古埃及人利用其制成的书写载体，曾被欧洲人和阿拉伯人使用，历3 000年不衰，直至公元8世纪，中国造纸术传到中东取代了莎草纸[1,2]。

纸莎草具有很强的水体净化功能，多被培育和改良为水体景观植物[3]。目前国内外对纸莎草的研究主要在其水质净化功能方面，关于其化学成分的研究不多，生物活性方面除了美白护肤作用外鲜有报道[4]。纸莎草的同科同属植物莎草(C.rotundus)的干燥根茎为《中国药典》收载的常用中药香附，具有解热镇痛和抗炎等活性，临床常用于治疗痛经、月经失调和胃肠紊乱等病症[5]。核因子-κB(NF-κB)是细胞内重要的核转录因子，它参与机体的炎症反应和免疫应答过程，NF-κB信号通路的过度激活，与人类包括癌症在内的多种炎症相关性疾病的发生发展关系密切，因此抑制NF-κB信号通路的过度活化，有可能成为相关疾病的治疗手段[6]。为了深入研究纸莎草化学及活性成分，对纸莎草全株进行了研究，从中分离鉴定了19个化合物，并发现了9个对TNF-α诱导激活的NF-κB信号通路有抑制作用的活性化合物。

1 实验部分

1.1 植物材料

纸莎草全株由昆明植分生物技术有限公司于2018年8月采集于昆明马金铺，样品经云南中医药大学李国栋副教授鉴定为纸莎草的全草(Cyperuspapyrus)，标本(YMU-ZF20180917)保存于民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室。

1.2 仪器与试剂

制备、半制备HPLC及LC/MS流动相所用有机溶剂为色谱级甲醇和乙腈(霍尼韦尔，美国)，水为纯净水(娃哈哈，中国)；其他化学试剂均为分析纯(云南利妍科技，中国)；Sephadex LH-20(GE Healthcare，美国)；柱色谱用MCI GEL CHP20/P120填料(三菱化学，日本)；薄层色谱硅胶板GF254(青岛海洋，中国)；柱色谱用硅胶(60～100、100～200、200～300、300～400目；青岛海洋，中国)；显色剂：10%磷钼酸-乙醇溶液和茴香醛、10%硫酸-乙醇溶液(105 ℃加热显色)、5%硫酸-乙醇溶液、碘；DMEM培养基、胎牛血清、谷氨酰胺(Biological Industries，以色列)；Lipofectamine 2000(ThermoFisher，美国)；地塞米松(Aladdin，中国)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，美国)。

EYELA N-1100自动旋转蒸发仪(上海爱朗，中国)；EYELA OSB-2100水浴锅(上海爱朗，中国)；NP7000泵-NU3000制备液相(江苏汉邦，中国)；6420 Triple Quad LC/MS(Agilent，美国)；1260 Infinity半制备高效液相色谱(Agilent，美国)；DRX-400和DRX-600型核磁共振仪(Bruker，瑞士)；BS124S型电子分析天平(Sartorius，德国)；Spectra Max i3x型酶标仪(Molecular Devices，美国)；5424R型离心机(Eppendorf，德国)；二氧化碳培养箱(ThermoFisher，美国)；5977 MSD旋光仪(Agilent，美国)。

1.3 实验方法与步骤

1.3.1 提取与分离

纸莎草(12 kg)干燥样品粉碎后，用95%甲醇冷浸提取6次，每次48 h，合并提取液，提取液经过滤、减压浓缩后得浸膏1 kg。将提取物浸膏混悬于适量温水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并浓缩液得到石油醚部分浸膏75 g，乙酸乙酯部分浸膏100 g和正丁醇部分浸膏12 g。石油醚部分浸膏(75 g)先用MCI除色素及分离，洗脱梯度为50%、70%、90%、100%甲醇/水，经TLC检测合并相同组分，共得到10个组分，分别记为FrA.1～FrA.10。70%甲醇/水洗脱部分(FrA.4)用60～100目硅胶拌样进行正相硅胶柱色谱分离，洗脱梯度系统为石油醚∶二氯甲烷(1∶0→0∶1)，经TLC检测合并相同组分，共得到5个组分，分别记为A4.1～A4.5。A4.2先后用硅胶[洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(1∶0→25∶1)]及Sephadex LH-20[洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]柱层析分离，得到化合物1(10.5 mg)和7(7 mg)。A4.3先后用硅胶[洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(50∶1→1∶1)]及Sephadex LH-20柱层析[洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶2)]分离纯化，得到化合物2(20 mg)和9(10 mg)。70%甲醇/水洗脱部分(FrA.5)用60～100目硅胶拌样进行柱色谱分离，洗脱系统为石油醚∶二氯甲烷 =1∶0→0∶1，经TLC检测合并相同组分，共得到4个组分，分别记为A5.1～A5.4。A5.3先后用硅胶[洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]与Sephadex LH-20柱层析(洗脱剂：甲醇)分离纯化，得到化合物3(8 mg)和4(9 mg)。90%甲醇/水洗脱部分(FrA.8)用制备高效液相色谱[洗脱剂：甲醇∶水(68∶32)，流速8.0 mL/min]进行色谱分离，共得到5个组分，分别记为A8.1～A8.5。A8.3先后用硅胶 [洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→5∶1)]与Sephadex LH-20柱层析[洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分离纯化，得到化合物5(22.5 mg)、6(10 mg)和8(8 mg)。乙酸乙酯部分浸膏(100 g)先用MCI除色素及分离，洗脱梯度系统为50%、70%、90%、100%甲醇/水，经TLC检测合并相同组分，共得到8个组分，分别记为FrB.1～FrB.8。70%甲醇/水部分(FrB.4)用60～100目硅胶拌样进行柱色谱分离，洗脱梯度系统为石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→0∶1)，经TLC检测合并相同组分，共得到5个组分，分别记为B4.1～B4.5。B4.2先后用硅胶 [洗脱剂：石油醚∶乙酸乙酯(50∶0→1∶1)]与Sephadex LH-20 柱层析 [洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分离纯化，得到化合物11(14 mg)和19(23 mg)。B4.3先后用硅胶柱层析 [洗脱剂：二氯甲烷∶甲醇(100∶1→10∶1)]和半制备高效液相色谱 [洗脱剂：甲醇∶水 =70∶30，流速为1.0 mL/min]进行色谱分离纯化，分别得到化合物10(18 mg，tR=35 min)和14(14 mg，tR=40 min)。B4.4先后用硅胶[洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]与Sephadex LH-20柱层析(洗脱剂：甲醇)分离纯化，得到化合物15(15 mg)。90%甲醇/水部分(FrB.7)用60～100目硅胶拌样进行柱色谱分离，洗脱梯度系统为石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→0∶1)，经TLC检测合并相同组分，共得到6个组分，分别记为B7.1～B7.6。B7.3先后用硅胶[洗脱剂：石油醚∶乙酸乙酯(50∶0→1∶1)]与Sephadex LH-20柱层析[洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分离纯化，得到化合物12(12 mg)。B7.4先后用硅胶柱层析[洗脱剂：二氯甲烷∶甲醇(100∶1→25∶1)]、Sephadex LH-20柱层析 [洗脱剂：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]和半制备高效液相色谱[洗脱剂：甲醇∶水 =60∶40，流速为1.0 mL/min]进行色谱分离纯化，分别得到化合物13(10 mg，tR=30 min)和16(8 mg，tR=36 min)。B7.5先后用硅胶柱层析[洗脱剂：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]与Sephadex LH-20(洗脱剂：甲醇)分离纯化，得到化合物17(20 mg)和18(10 mg)。

1.3.2 双荧光素酶报告基因实验

参照前期的实验方法[7]：将HEK293T细胞(人胚肾细胞)培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并放置于37 ℃，含5% CO2的细胞培养箱内。细胞接种于24孔板中24 h后，用Lipofectamine 2000转染pNF-κB-luc和pRL-TK质粒后继续培养18 h，加入不同浓度的待测化合物孵育4 h后加入10 ng/mL TNF-α再继续培养4 h。之后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测化合物1～19对NF-κB信号通路活性的影响。

2 实验结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物15无色液体;分子式为C18H32O2，分子量280。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(4H，m，H-9，H-10，H-12，H-13)，2.78(2H，t，J=6.4 Hz，H-11)，2.36(1H，t，J=7.2 Hz，H-2)，2.04(4H，m，H-8，H-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：179.5(C-1)，130.2(C-12)，130.0(C-10)，129.7(C-13)，128.0(C-9)，34.0(C-2)，31.9(C-16)，31.5(C-6)，29.7(C-7)，29.2(C-15)，27.2(C-8、C14)，25.6(C-11)，24.7(C-3)，22.7(C-17)，14.1(C-18)。以上数据与文献[21]报道数据基本一致，故鉴定化合物15为顺，顺-9，12-十八(碳)二烯酸。

化合物16无色油状物;分子式为C17H34O2，分子量270。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.66(3H，s，H-17)，2.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.62(2H，q，J=7.5 Hz，H-3)，1.25(24H，m，H-4～H-15)，0.89(3H，t，J=6.7 Hz，H-16)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：175.8(C-1)，49.3(-OMe)，33.2(C-2)，30.9(C-14)，28.7(C-8、C-10、C-12)，28.6(C-7)，28.5(C-6)，28.4(C-9、C-11、C-13)，28.3(C-5)，28.2(C-4)，24.0(C-3)，21.7(C-15)，13.1(C-16)。以上数据与文献[22]报道数据基本一致，故鉴定化合物16为棕榈酸甲酯。

化合物17无色油状物;分子式为C28H56O2，分子量424。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.36(2H，m，H-2)，1.62(2H，m，H-3)，1.25(48H，m，H-4～H-27)，0.89(3H，m，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.1(C-1)，32.9(C-2～C-18)，30.9(C-19)，28.7(C-20)，28.6(C-21)，28.4(C-22)，28.3(C-23)，28.2(C-24)，28.1(C-25)，23.7(C-26)，21.7(C-27)，13.1(C-28)。以上数据与文献[23]报道数据基本一致，故鉴定化合物17为正二十八烷酸。

化合物19白色固体;分子式为C19H36Cl2O2，分子量366。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.51(3H，s，H-19)，2.16(2H，m，H-2)，3.89(2H，m，H-9，H-10)，1.41～1.11(26H，m，H-3～H-8，H-11～H-17)，0.81(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：174.1(C-1)，64.4(C-9、C-10)，51.5(-OMe)，34.4(C-8、C-11)，34.1(C-2)，31.9(C-16)，29.7(C-15)，29.5(C-5)，29.4(C-4)，29.3(C-6)，29.2(C-14)，28.7(C-13)，26.0(C-7、C-12)，25.1(C-3)，22.7(C-17)，14.1(C-18)。以上数据与文献[25]报道数据基本一致，故鉴定化合物19为9,10-二氯-十八烷酸甲酯。

2.2 NF-κB通路抑制活性

双荧光素酶报告基因检测法考察了化合物1～19对质粒转染的HEK293T细胞中NF-κB信号通路的影响，发现化合物1、2、3、5、6、10、12、13和16在最高100 μM浓度下对TNF-α诱导激活的NF-κB信号通路有抑制作用，半数抑制浓度(IC50)值在34.96～98.23 μM之间，其中桉烷型倍半萜化合物6活性最强，IC50值为34.96 ± 0.61 μM(见表1)。

表1 化合物对TNF-α活化的NF-κB通路的抑制活性

3 讨论与结论

对纸莎草的化学及活性成分进行了研究，从其甲醇提取物中分离得到了19个化合物，化合物类型包括倍半萜(1～6)、甾体(7～14)和脂肪酸(15～19)，所有化合物均为首次从纸莎草中分离得到，丰富了纸莎草及莎草属植物的化学成分研究。通过抗炎活性研究，发现了9个对TNF-α诱导激活的NF-κB信号通路有抑制作用的活性化合物，活性化合物主要为倍半萜和甾体类化合物，其中倍半萜类化合物活性较强，尤其是桉烷型倍半萜(1和6)，这与我们前期关于其同属植物莎草的研究结果一致[7]。莎草属植物中富含倍半萜类成分[8,10,11]，我们的研究发现，倍半萜类成分是纸莎草中具有潜在抗炎作用的活性成分，尤其是桉烷型倍半萜。为了合理开发利用该植物资源，有必要对纸莎草中的活性成分开展进一步的系统研究，深入探讨其活性机理及开展其体内活性验证。本研究为后续关于纸莎草及莎草属植物的生物活性研究提供了物质及理论支持。