5个抗病基因功能标记在234份番茄材料中的检测

陈莉菁 刘子记 谢尚潜 凌鹏 朱婕

摘  要：番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，病害的发生和蔓延使番茄生产受到严重影响，培育多抗番茄品种是防治病害最为经济和有效的方法。本研究利用功能标记对234份番茄材料进行Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a等5个抗病基因的检测，发现其中含Cf-9的番茄材料为136份，含Mi-1的材料为20份，含I-2的材料为124份，含Ph-3的材料38份，含Tm-2a的材料为24份。234份番茄材料中，不含这5个抗病基因的材料有29份;含1个抗病基因的材料有106份;含2个抗病基因的材料有70份;含3个抗病基因的材料有23份;含4个抗病基因的材料有6份，分别为11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;同时含这5个抗性基因的番茄材料尚未检测到。该研究结果将为进一步开展多个抗病基因的聚合育种提供参考依据。

关键词：番茄;功能标记;抗病基因;聚合育种

中图分类号：S641.2      文献标识码：A

Detection of Five Disease Resistance Genes in 234 Tomato Materials with Functional Markers

CHEN Lijing1，2， LIU Ziji3， XIE Shangqian2， LING Peng2， ZHU Jie1，2

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Tomato is one of the most important vegetable crops in the world. Tomato production is seriously affected by the occurrence and spread of diseases. It is the most economical and effective way to control diseases by cultivating varieties with multiple resistant genes to different diseases. Functional markers were used to test the appearance of Cf-9， Mi-1， I-2， Ph-3 and Tm-2a genes in 234 tomato materials. Cf-9 was found in 136 materials. Mi-1 was found in 20 materials. I-2 was found in 124 materials. Ph-3 was found in 38 materials. And Tm-2a was found in 24 materials. Among the 234 tomato materials， 29 did not contain any of these five resistant genes， 106 contained one resistant gene， 70 contained two resistant genes， 23 contained three resistant genes， 6 contained four resistant genes （line 11CT387-2M， 11CHT164-2， 11CT150， 11CT271， 11CT730 and 11CT774）. None of the materials had five resistant genes. The results would lay a foundation for resistance genes pyramiding in the future.

Keywords： tomato; functional marker; resistance gene; multiple genes pyramiding

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.025

番茄（Solanum lycopersicum L.）色彩鮮艳，营养丰富，既可作为蔬菜，又可作为水果食用，且加工潜力较大，是世界上经济效益最高、栽培最广泛的园艺作物之一。番茄是典型的设施栽培作物，极易受到设施的特殊环境、连作障碍及病害的影响。迄今为止已发现的番茄病害达200多种，其中较严重的病害包括40余种，极大影响了番茄的产量和质量[1]。因此，选育抗病性强的番茄品种显得尤为关键。迄今为止，在番茄中定位并克隆了一批抗病基因，包括番茄烟草花叶病毒病、叶霉病、晚疫病、枯萎病和根结线虫病抗性基因等。

番茄叶霉病由半知菌（Cladosporium fulvum）引起。目前发现的叶霉病抗性基因至少有24个（Cf-1至Cf-24）。通过Ac-Ds转座子标签法克隆了Cf-4和Cf-9基因[2-3]，后又通过图位克隆法获得了Cf-2和Cf-5基因序列[4-5]。比较分析发现，已克隆的这几个Cf基因均属于LRR-TM类型，不同Cf基因亮氨酸重复数目不同，决定了对叶霉病菌不同生理小种的识别[6]。Cf基因属于多基因家族，已克隆的Cf-4/Cf-9、Cf-2/Cf-5分别集中于番茄1号和6号染色体上，形成2个复合基因座[3， 7]。截至目前，Cf-9是利用最为广泛的抗叶霉病基因。

根结线虫对茄科作物的危害尤为严重。番茄中已定位了9个抗根结线虫基因（Mi-1至Mi-9）。Mi-1是目前在番茄中唯一被克隆的抗根结线虫基因。Mi-1位点含有同源基因Mi-1.1和Mi-1.2，其中Mi-1.1并不具有抗性，而Mi-1.2才是真正的根结线虫抗性基因。Mi-1.2基因编码一条含1257个氨基酸的多肽，属于LZ-NBS-LRR类型抗性基因[8]。

番茄枯萎病由番茄尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起，致病生理小种有1号、2号和3号3种[9]。常用的番茄枯萎病抗病基因有I-1、I-2和I-3，其中I-2能兼抗1号和2号小种，具有较大的应用价值。Simons等[10]利用图位克隆法分离I-2基因，发现该基因编码一条含1266个氨基酸的多肽，属于NBS-LRR类型抗性基因。

目前已被鉴定的番茄晚疫病抗性基因包括Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4和Ph-5。其中Ph-3是一个部分显性基因，对晚疫病菌的多个生理小种都具有抗性[11]。Ph-3基因已经被转育到优良的栽培种中，并在生产实践中表现出较好的抗性[12]。张春芝[11]利用图位克隆法分离了Ph-3基因，发现该基因编码一条851个氨基酸的多肽，属于CC-NBS-LRR类型抗性基因。

番茄花叶病毒病抗性主要由Tm-1、Tm-2和Tm-2a（Tm-22）等基因位点控制，其中以Tm-2a抗性最为持久[13]。Lanfermeijer等[14]利用转座子标签法解析Tm-2a位点，发现该位点的抗病性由单基因控制，Tm-2a基因编码一条含861个氨基酸的多肽，属于CC-NBS-LRR类型抗性基因。

在抗病品种的培育过程中，利用传统方法育种周期较长，且具有较大的盲目性。利用分子标记技术辅助育种，可以在苗期进行大量的抗病性鉴定，不受时间地域限制，能显著加速育种进程[15]。功能分子标记即基因特异性标记，是基于目标基因本身的核苷酸序列在不同个体间的差异而开发的分子标记。相比于其他类型的分子标记，功能标记最大的优点是与目标基因共分离，故与目标基因的表现型高度一致，是一种非常理想的分子标记类型。

本研究将利用番茄Cf-9、Mi-1、I-2、Ph-3和Tm-2a这5个抗病基因的功能分子标记对234份番茄育种材料进行检测，明确不同材料含有的抗病基因情况。

1  材料與方法

1.1  材料

本研究检测的234份番茄材料中，1～37号为市售商业品种，38～234号为中国热带农业科学院提供的育种材料（表1）。将番茄材料盆栽于海南大学农科楼温室，用于基因组DNA提取及抗病基因检测。

1.2  方法

1.2.1  番茄总DNA提取  番茄种子浸种12 h后播种，25 ℃下培育30 d，待长出3～4片子叶，采用CTAB法提取总DNA[16]，?20 ℃保存。

1.2.2  番茄抗性基因功能标记的PCR反应体系利用番茄抗叶霉病基因Cf-9、抗根结线虫基因Mi-1、抗枯萎病基因I-2、抗晚疫病基因Ph-3和抗烟草花叶病毒病基因Tm-2a这5个抗病基因的功能标记开展鉴定工作，标记具体信息见表2。5个番茄抗性基因功能标记采用相同的PCR反应体系和程序。25 μL PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，8 μmol/L正反向引物各2 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL和Taq DNA聚合酶1.25 U，ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性1 min，合适温度退火1 min，72 ℃延伸80 s， 32个循环;72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。其中需要用限制性内切酶TaqⅠ对根结线虫抗性基因Mi-1的PCR产物进行酶切，20 μL酶切体系包括1×TaqⅠ Buffer，5U TaqⅠ内切酶和15 μL PCR反应产物，65 ℃酶切12 h。

2  结果与分析

2.1  叶霉病抗性基因Cf-9检测

Cf-9功能标记为显性标记，含有Cf-9基因的番茄材料可扩增出415 bp的条带，不含Cf-9基因的番茄材料则无扩增产物（图1）。经检测显示，234份番茄材料中，含Cf-9抗性基因的材料有136份，其余98份不含该基因。

2.2  根结线虫抗性基因Mi-1检测

Mi-1功能标记为共显性标记，所有番茄材料均能扩增出750 bp特异性条带，经TaqⅠ酶切后，出现3种带型（图2）。第1种带型含有570 bp和180 bp条带，代表纯合的Mi-1抗性位点;第2种带型仅包含750 bp的条带，无法被酶切，代表该材料不含Mi-1抗性基因;第3种带型包括750、570、180 bp 3种条带，代表杂合的Mi-1抗性位点。经检测显示，234份番茄材料中，含Mi-1纯合抗性位点的材料有9份，含杂合抗性位点的材料有11份，不含该抗性基因的材料有214份。

2.3  枯萎病抗性基因I-2检测

I-2功能标记为共显性标记，可扩增出3种带型（图3）。第1种带型含有1条590 bp条带，代表纯合的I-2抗性位点;第2种带型含有2条640 bp条带，代表不含I-2抗性基因;第3种带型含有590 bp和640 bp 2个条带，代表杂合的I-2抗性位点。经检测显示，234份番茄材料中，含I-2纯合抗性位点的材料有66份，含杂合抗性位点的材料有58份，不含该抗性基因的材料有110份。

2.4  晚疫病抗性基因Ph-3检测

Ph-3功能标记为共显性标记，可扩增出3种带型（图4）。第1种带型只含有1条376 bp条带，代表纯合的Ph-3抗性基因;第2种带型则含有1条682 bp条带，代表不含Ph-3抗性基因;第3种带型含有376和682 bp 2个条带，代表杂合的Ph-3抗性位点。经检测显示，234份番茄材料中，含Ph-3纯合抗性位点的材料有7份，含杂合抗性位点的材料有31份，不含该抗性基因的材料有196份。

2.5  烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a检测

Tm-2a功能标记为显性标记，可扩增出2种帶型（图5）。含Tm-2a抗性基因的材料可扩增出1条472 bp的条带;不含该抗性基因则无扩增产物。经检测显示，234份番茄材料中，含Tm-2a抗性基因的材料有24份，其余210份材料不含该基因。

2.6  5个番茄抗性基因功能标记检测结果

本研究检测的234份不同类型番茄材料中，完全不含5个抗性基因的材料有29份，只含1个抗性基因的材料有106份，同时含2个抗性基因的材料有70份，含3个抗性基因的材料有24份，含4个抗性基因的材料有6份，分别为11CT387-2M、11CHT164-2、11CT150、11CT271、11CT730和11CT774;尚未检测到同时含这5个抗性基因的番茄材料（表3）。

3  讨论

番茄是全世界大宗的蔬菜作物之一，连作和设施栽培等因素加剧了病害的蔓延。聚合多个抗病基因是番茄抗病育种的重要手段。苏晓梅[21]利用Mi-1和Ty-1功能标记检测83份番茄材料，发现其中24份材料同时含有这2个抗病基因。暴会会等[22]对32份番茄材料进行7个抗病基因的检测，发现只有9份材料含有2个抗病基因，未检测到含有3个以上抗病基因的材料。可见抗病基因聚合的效率并不太高。本研究中，仅42%番茄材料检测出了含2种以上的抗病基因，其中聚合3～4个抗病基因的材料仅占12%，未检测到聚合5个抗病基因的材料。由此可见，仍需加大抗病基因聚合的力度，为培育多抗番茄品种奠定基础。本研究使用的37个商业品种中，聚合3个抗病基因的材料占43%，说明番茄商业化育种进程中，抗病基因聚合的力度正在加大，多抗育种受到了越来越高的重视。

本研究使用的234份番茄材料，从果形上看，大果类型为119份，小果类型为115份，数量相近，约各占1/2。在这2种果实类型中均以检测到1～2个抗病基因为主，且大果类型中完全不含这5个抗病基因的材料略多于小果类型。从果色上看，有红色134份、粉色36份、黄色50份、绿色5份、黑色6份、紫色3份，不同果色材料均以含1～2个抗病基因为主。从本研究得到的数据来看，不同果形和果色的番茄材料在抗病育种上的进展程度相对比较一致。含3～4个抗病基因的30份材料中，红色大果为12份，占比40%，由此推断，红色大果相对较受市场和育种家的重视，抗病聚合育种进展较快。

番茄抗叶霉病育种工作开展得较早。20世纪30年代初，欧美国家已普遍将叶霉病抗性基因用于商业生产。其中Cf-9基因在田间生产中对叶霉病菌多个生理小种的抑制作用均较强，已经被广泛地导入到栽培番茄优良品种中[23]。王亮等[24]对218份加工番茄骨干自交系材料进行抗病基因检测，发现其中74份材料含有Cf-9基因，所占比例较大。本研究中Cf-9在不同番茄材料中的存在频率也较高（达58%），进一步表明Cf-9基因在番茄抗病育种中使用比较广泛。另外，I-2基因在本研究番茄材料中存在的频率较高，达53%。I-2基因来源于醋栗番茄（Lycopersicon pimpinelifolium），由于能兼抗番茄枯萎病1号和2号2个主要生理小种，受到育种家的普遍重视，被频繁用于番茄枯萎病抗性育种，起到了举足轻重的作用。本研究中的其余3个抗病基因在番茄材料中存在的频率相对较低（Mi-1为9%;Tm-2a为10%;Ph-3为16%），在今后的育种工作中需加强对这些基因的选择和应用。

总体来说，与传统育种方式相比，分子标记辅助育种操作简便，能加快抗病基因的聚合，提高选种育种的精准性，并能适当缩短育种年限，是一种前景广阔的农业生物技术手段。本研究利用5个抗病基因的功能标记对234份番茄材料进行了检测，筛选出的抗病材料可进一步用于多抗聚合育种，再结合所选材料的其他优良性状表型，为培育多抗、优良的番茄新品种提供参考依据。

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责任编辑：黄东杰