辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞内免疫相关酶活性的影响

王良刚，成 静，谢小东，季 露，孙钰博，胡庭俊，韦英益，覃志彪

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

南美白对虾是一种甲壳类动物，缺乏完整的特异性免疫机制。当南美白对虾受到有害刺激时，机体的免疫应答主要依靠非特异性免疫反应完成[1]。南美白对虾的甲壳和表皮构成了第一道非特异性屏障，细胞免疫和体液免疫协同完成机体的免疫应答。因南美白对虾体内缺乏免疫球蛋白，其体液免疫主要依靠非特异性的酶或者其他免疫因子共同完成[2-3]，南美白对虾血淋巴细胞则承担着十分重要的免疫保护职责。酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、酚氧化酶（PO）和超氧化物歧化酶（SOD）等是几种典型的非特异性免疫酶，能够反映细胞的免疫能力。辣蓼的主要化学成有黄酮类、挥发油、糅质类、脂肪酸、三萜类、蒽醌、糖苷和蓼酸等。研究表明，辣蓼主要成分黄酮具有生物抗氧化性、清除自由基、杀虫、抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、镇痛止血等多种生物活性[4]。本研究通过体外分离和培养南美白对虾血淋巴细胞后，将不同浓度的辣蓼黄酮提取物添加到细胞培养液中，观察其对南美白对虾血淋巴细胞存活率的影响，并测定细胞内ACP、AKP、PO和SOD等非特异性免疫酶的活性，探讨辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康的南美白对虾600尾，体长为12～15 cm，购自广西水产科学研究院南美白对虾良种基地。

1.2 试验材料

辣蓼黄酮提取物，为广西大学动物科学技术学院药理实验室采用醇沉法提取后制成的制剂，测定其黄酮含量约为7.51%。

黄芪多糖，淡黄色粉末，购自北京生泰尔生物有限公司，总糖含量为70%。

1.3 试剂及仪器

胎牛血清购自Biological industries；DMEM购自Gibco公司；DMSO和左旋多巴（L-DOPA）购自北京索莱宝科技有限公司；酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶等试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自碧云天。

MCO-170AICDL-PC二氧化碳培养箱（Panasonic）、EnSpire多功能酶标仪（Perkin Elmer）、CD-UPT-II-20L纯水仪（成都越纯科技有限公司）、5430R高速冷冻台式离心机（EPPENDORF）。

1.4 试剂配制

1.4.1 DMEM完全培养液

DMEM按照说明书进行配制后，加入胎牛血清（10%）、青霉素（1%）和链霉素（1%）。

1.4.2 不同浓度辣蓼黄酮提取物培养液

使用终浓度为0.5%DMSO溶解辣蓼黄酮提取物，然后使用DMEM完全培养液将其稀释成浓度为1 600μg/mL的辣蓼提取物，15 000 r/min，离心30 min，弃去沉淀；滤过除菌后再加入DMEM完全培养液进行倍比稀释为不同浓度（800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL）。

1.4.3 对照药物培养液

使用DMEM培养液溶解黄芪多糖至浓度为1 600μg/mL，滤过除菌后再加入DMEM培养液倍比稀释为 不 同 浓 度（800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）的黄芪多糖培养液。

1.4.4 0.5%DMSO培养液

向DMEM培养液中添加0.5%体积的DMSO。

1.5 南美白对虾血淋巴细胞的体外分离与培养

取健康南美白对虾，清洗体表，在0.01%的高锰酸钾溶液中浸泡5 min，双蒸水冲洗。用酒精棉球消毒头胸甲与腹部交界处，使用无菌注射器吸取适量抗凝剂（5%柠檬酸三钠），血窦采血，将其注射到15 mL无菌Ep管中（每管约盛10 mL），轻轻混匀，加少量抗凝剂调整配平；4℃条件下，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入DMEM完全培养液吹打均匀重悬沉淀细胞，稀释细胞浓度至8×106个/mL。

1.6 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞活性的影响

1.6.1 试验设计

采用96孔细胞培养板法进行细胞培养，为避免边缘效应，将培养板外围一圈每孔加入200μL PBS后使用。试验设置细胞对照组、DMSO对照组、辣蓼黄酮不同剂量组（1 600.0、800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）和黄芪多糖不同剂量组（1 600.0、800.0、400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5μg/mL）。各组每孔各加入200μL的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养12 h左右（29℃，5%CO2），待细胞贴壁后小心弃去上清液。向细胞对照组加入200μL DMEM培养液；向各药物组每孔加入200μL不同浓度的辣蓼黄酮提取物培养液或不同浓度的黄芪多糖培养液；向DMSO组加入200μL 0.5%DMSO对照培养液；每组设置5个重复。

1.6.2 CCK8法测定细胞活力

将培养板放入培养箱敷育24 h后弃去上清，使用PBS小心对细胞进行3次洗涤。避光操作下，向每孔加入200μL DMEM培养液及20μL CCK8培养敷育1 h，在450 nm处检测吸光值，按以下公式计算细胞活力：

1.7 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾细胞内免疫相关酶活性的影响

1.7.1 试验设计

使用24孔板培养细胞，每孔加入1.0 mL的细胞悬液，将培养板在培养箱内预培养12 h（29℃，5%CO2）。待细胞贴壁后轻轻吸取并弃去上清液，空白对照组每孔加入1.0 mL DMEM培养液；对照药物组每孔加入1.0 mL浓度为100μg/mL的黄芪多糖培养液；辣蓼药物组每孔加入1.0 mL相应浓度（12.5～100.0μg/mL）的辣蓼黄酮提取物培养液；将培养板放入培养箱培养一段时间（4、8、12、24 h）。轻轻弃去上清，用PBS小心对细胞进行3次洗涤，加入1.0 mL PBS溶液，仔细刮下细胞，收集备用。

1.7.2 ACP、AKP、PO和SOD酶活性的测定

细胞内ACP、AKP和SOD等酶活性测定按照相应试剂盒的操作说明进行。细胞内PO的活性测定参照Ashida[7]的方法进行调整，依次向96孔板中加入100μL浓度为0.1 mol/L pH值6.0的磷酸钾缓冲液、100μL待测液、100μL 0.01 mol/L的L-DOPA液，在490 nm处测定OD值，每2 min测定1次，连续测定20 min，以OD值增加0.001为1个酶活力单位。

1.8 数据统计与分析

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），结果以“平均数±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞活力的影响（见表1）

由表1可知，与细胞对照组相比，0.5%DMSO对照组的细胞活力无显著差异（P＞0.05）；浓度为12.5～50μg/mL辣蓼黄酮提取物能显著提高南美白对虾血淋巴细胞活力，其中25μg/mL辣蓼黄酮提取物试验组差异显著（P＜0.05），50μg/mL辣蓼黄酮提取物试验组差异极显著（P＜0.01）；辣蓼黄酮提取物浓度为400～1 600μg/mL时，极显著减弱对虾血淋巴细胞的细胞活力（P＜0.01）。而黄芪多糖药物对照组的浓度为12.5μg/mL和200μg/mL时，与细胞对照组比较差异不显著（P＞0.05），浓度为25～100μg/mL的黄芪多糖极显著增强细胞活力（P＜0.01），黄芪多糖浓度为400～1 600μg/mL时，极显著减弱细胞活力（P＜0.01）。结果表明，一定浓度的辣蓼黄酮提取物可提高南美白对虾血淋巴细胞的细胞活性，并选取浓度为12.5～100.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物作为后续试验药物浓度以及100μg/mL黄芪多糖作为后续试验药物对照组的浓度。

表1 南美白对虾血淋巴细胞活力的测定结果（n=5）Tab.1 Determination of blood lymphocyteactivity of Penaeusvannamei

2.2 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞内免疫相关酶活性的影响（见表2～表5）

由表2可知，与空白对照组相比，南美白对虾血淋巴细胞培养4 h后，12.5μg/mL辣蓼黄酮提取物能显著提高细胞中的ACP活性（P＜0.05），浓度为50μg/mL时，极显著提高细胞中的ACP活性（P＜0.01）；培养8 h后，100μg/mL的黄芪多糖和100μg/mL的辣蓼黄酮提取物能极显著提高细胞中的ACP活性（P＜0.01）；培养12 h后，12.5μg/mL辣蓼黄酮提取物升高细胞中的ACP活性，但差异不显著（P＞0.05），而25μg/mL和50μg/mL的辣蓼黄酮提取物能极显著降低细胞内ACP活性（P＜0.01）；培养24 h后，各试验组细胞内ACP活性与对照组比较差异不显著（P＞0.05）。结果表明，一定浓度辣蓼黄酮提取物能提高南美白对虾血淋巴细胞内酸性磷酸酶（ACP）的活性。

表2 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾淋巴细胞内ACP活性的影响Tab.2 Effect of FPH on ACPactivity in lymphocytesof Penaeusvannamei 单位：U/g prot

由表3可知，与空白对照组相比，第4 h时，50μg/mL的辣蓼黄酮提取物能极显著提高细胞内AKP活性（P＜0.01）；第8 h时，25μg/mL辣蓼黄酮提取物能显著提高细胞中的AKP活性（P＜0.05），50μg/mL和100μg/mL辣蓼黄酮提取物能极显著提高细胞内AKP活性（P＜0.01）；培养第12 h时，50μg/mL、100μg/mL辣蓼黄酮提取物能极显著提高细胞内AKP活性（P＜0.01），100μg/mL的黄芪多糖能显著提高细胞内AKP活性（P＜0.05）；第24 h时，100μg/mL的黄芪多糖和浓度为12.5～100μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞内AKP活性（P＜0.01）。结果表明，辣蓼黄酮提取物能显著提高南美白对虾血淋巴细胞内碱性磷酸酶（AKP）活性。

表3 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞内AKP活性的影响Tab.3 Effect of FPH on AKPactivities in lymphocytes of Penaeus vannamei 单位：U/g prot

由表4可知，与空白对照组相比，第4 h时，浓度为100μg/mL的黄芪多糖和12.5～100.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞内PO活性（P＜0.01）；第8 h时，100μg/mL的黄芪多糖和50～100μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞内PO活性（P＜0.01）；第12 h和24 h时，100μg/mL的黄芪多糖和12.5～100.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞中的PO活性（P＜0.01）。结果表明，辣蓼黄酮提取物能显著升高细胞内PO活性。

表4 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞内PO活性的影响Tab.4 Effect of FPH on POactivities in lymphocytes of Penaeus vannamei 单位：U/g prot

由表5可知，与空白对照组相比，第4 h时，100μg/mL的黄芪多糖和25μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能显著提高细胞内SOD活性（P＜0.05）；第8 h时，100μg/mL的黄芪多糖能极显著提高细胞中的SOD活性（P＜0.01），50μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能显著提 高 细 胞 内SOD活 性（P＜0.05）；第12 h时，12.5～100.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞中的SOD活性（P＜0.01）；第24 h时，100μg/mL的黄芪多糖能显著提高细胞中的SOD活性（P＜0.05），12.5～50.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物均能极显著提高细胞中的SOD活性（P＜0.01）。结果表明，辣蓼黄酮提取物能提高南美白对虾血淋巴细胞内SOD活性。

表5 辣蓼黄酮提取物对南美白对虾血淋巴细胞内SOD活性的影响Tab.5 Effect of FPH on SOD activitiesin lymphocytesof Penaeusvannamei 单位：U/g prot

3 讨论

南美白对虾与其他无脊椎动物一样，没有获得性免疫系统，它们仅靠由种系基因编码而成的一种“模式识别受体”以及其相关的先天免疫系统来保护自身免受病原体侵害[3,5]。无脊椎动物的先天免疫系统是1个复杂的蛋白水解级联系统，该系统可以由病原体的成分触发[6]。南美白对虾的免疫系统主要包括血淋巴中的细胞和体液免疫，其中包含的免疫分子参与了机体的防控机制，并可对环境波动作出反应[7]。中草药具有影响和调节动物机体免疫功能，且不易产生耐药性，在虾类养殖上已得到广泛应用[8]，例如在基础饲料中分别添加甘草、板蓝根和黄芪多糖复合物能有效提高虾的生长性能、免疫功能以及改善肝胰腺组织结构和功能[9]；茯苓能有效促进对虾的生长性能，而黄芪、板蓝根、柴胡和甘草可以明显提高对虾抗病力和免疫力[10]。

本试验结果显示，DMSO对照组的南美白对虾血淋巴细胞活力接近100%，表明以0.5%的DMSO溶液作为溶剂溶解辣蓼黄酮提取物不会对南美白对虾细胞活性造成不利影响。而不同浓度辣蓼黄酮提取物（12.5～1 600.0μg/mL）添加至完全培养液后对南美白对虾血淋巴细胞的细胞活力的影响是随药物浓度的增加呈现先增加后下降变化，其中辣蓼黄酮提取物浓度在12.5～200.0μg/mL范围内不影响细胞活力，且浓度为25μg/mL和50μg/mL时能增强南美白对虾细胞血淋巴细胞活力；在400～1 600μg/mL浓度范围内细胞活力均低于100%，结果表明，当辣蓼黄酮提取物在此浓度范围内对南美白对虾血淋巴细胞活力具有抑制作用，且抑制作用随药物浓度的增高而增强。而不同浓度的黄芪多糖（12.5～1 600.0μg/mL）对南美白对虾血淋巴细胞的细胞活力影响也随药物浓度的增加出现先增加后降低的趋势，其中当浓度为100μg/mL时对细胞活力的具有最显著的增强作用，当药物浓度超过400μg/mL后，对细胞活力具有抑制作用。

已有研究表明，ACP、AKP、PO和SOD等防御酶在南美白对虾的非特异性免疫系统中扮演了重要角色[11-12]。ACP是典型的溶酶体酶，能帮助消除和水解有害微生物，当机体免疫系统受到侵袭时，机体内的ACP活性会有所增强[13-14]。作为经典的巨噬细胞溶酶体酶标记物，ACP在细胞代谢中也起着重要作用，可催化磷蛋白的水解和磷酸基团的转移[15-16]。在本试验中，以浓度为12.5～100.0μg/mL辣蓼黄酮提取物对体外培养至4 h和8 h的南美白对虾血淋巴细胞内ACP活性具有一定程度的增强作用；当培养至12、24 h时，各浓度的辣蓼黄酮提取物降低南美白对虾血淋巴细胞内ACP活性降低或与细胞对照组比较高差异不显著，与匡娜等[17]通过在饲料中添加甘蓼复合微生态制剂能显著提高对虾血清ACP活性的研究结果一致。AKP是与代谢相关的调节酶，可被作为评估南美白对虾免疫状态的重要指标，AKP通过催化磷酸基团的转移而发挥其重要的生理功能[15]。在本试验中，浓度为12.5～100μg/mL辣蓼黄酮提取物试验组中南美白对虾血淋巴细胞内的AKP活性高约细胞对照组，其中50μg/mL的辣蓼黄酮提取物试验组差异极显著。管振国等[18]在饲料中添加根瘤菌制剂可显著提高南美白对虾血清中AKP活性，本研究结果与其结果相一致。PO的活性与无脊椎动物的易感性呈负相关，是能体现动物免疫状态的敏感指标，亦可以作为评估南美白对虾健康状况的指标。研究表明，中草药具有增强PO活性、降低感染后死亡率的作用[13]。在本试验中，浓度为12.5～100.0μg/mL的辣蓼黄酮提取物试验组南美白对虾血淋巴细胞体外培养至4、8 h，其细胞内PO活性明显升高。

在细胞正常的有氧代谢过程中，会产生氧自由基（ROS）和活性氧中间体（ROI）。正常情况下，机体的活性氧产生和消除处于相对平衡状态[19]。过量ROS会导致脂质过氧化和丙二醛的积累，其中丙二醛具有很强的生物毒性并破坏细胞的结构和功能，还可能引起氧化应激，而抗氧化酶（如SOD）能够迅速清除ROS和ROI。因此，SOD也被广泛作为甲壳类动物防御能力的评估指标[20-22]。已有研究表明，在饲料中添加黄粉虫虫粉及其虫皮[23]或根瘤菌[18]都能有效提高南美白对虾细胞中的SOD活性。在本研究中，浓度为12.5～100.0μg/mL辣蓼黄酮提取物能升高南美白对虾细胞内SOD活性，从而提高对虾机体的抗氧化能力。

4 结论

辣蓼黄酮提取物能提高体外培养的南美白对虾血淋巴细胞的细胞活性，并通过升高细胞内免疫相关酶活性而增强对虾的免疫功能，有望开发作为南美白对虾的免疫增强剂。