晋麦47EMS突变体库的构建及高代突变材料品质性状的初步分析

张 婷 温宏伟 袁 凯 逯腊虎 史晓芳 张明义 姬虎太 杨 斌

(山西农业大学小麦研究所，山西临汾 041000)

小麦是我国主要粮食作物，提高小麦单产水平对保障我国粮食安全具有重要意义[1]。然而近年来旱地小麦育种中使用的亲本来源愈渐单一，遗传范围逐渐狭窄，导致育成品种的遗传相似性增加，产量、品质和对逆境的综合抗性也少有突破性进展，增加了小麦生产的安全隐患[2]，且传统育种周期长，自然变异率低，难以满足人口不断增长与可利用耕地面积不断减少背景下对小麦育种效率的迫切需求[3]。因此，如何高效创制优异种质资源，缩短育种年限，提高育种效率，是当前小麦抗旱育种工作中亟待解决的问题。

利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)进行诱变处理是目前最为有效的化学诱变技术。其操作简便，诱变率高，可以产生丰富的点突变，对材料损伤小，不易造成染色体畸变[4]，能够创制出常规育种技术难以得到的新性状[5]，被广泛用于小麦、小稻等[6－12]种质资源创制与遗传研究工作中。在小麦种质资源创制方面，孙玉龙等[13]通过EMS 诱变盛农1 号，对M3突变体库生物学特性和农艺性状进行调查，获得了18 个稳定遗传的变异株系；张贞彩等[14]对济麦20 和济麦22 EMS 诱变群体的M3种子进行理化特性分析，发现济麦22 诱变材料直链淀粉平均含量低于野生型，而济麦20 的相差不大，并筛选出2 个糊化粘度与诱变亲本差异较大的材料；张纪元等[15]利用EMS创制弱筋小麦品种宁麦9 号突变体库，获得了Ax1、Bx7、By8、Dx2、Dx12 和Ax1＋By8 缺失的高分子量谷蛋白亚基突变体，其谷蛋白大聚体和谷蛋白/醇溶蛋白比值较对照均有不同程度降低，为弱筋小麦育种提供了新的种质材料；Yasui 等[16]诱变处理面包小麦种子，在M2材料中发现了糯质小麦突变体，最终育成了糯质普通小麦新品系K107wx1 和K107wx2。在遗传研究方面，张维宏等[17]处理了小麦抗叶锈病近等基因系TcLr19 的种子，从M3中筛选到6 个感病突变体，为Lr19 基因功能研究提供了理想的材料；Kuraparthy等[18]利用EMS 突变体将控制分蘖的tin3 基因定位在3A 染色体的长臂上；Xu 等[19]利用EMS 突变体将控制分蘖数与株高的稳定主效数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)定位在2D 染色体的短臂上，为小麦株高和分蘖遗传研究奠定了基础；Lombardo 等[20]从EMS 诱变群体中筛选出27 个高分子量谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)的M3突变体，研究了HMW-GS 基因敲除在小麦品质和营养上的潜在应用。

虽然国内外已开展了许多关于小麦EMS 诱变的研究，但鲜有利用小麦抗旱品种构建EMS 突变体库并从中选育抗旱新品种的报道。鉴于此，本研究以全国旱地区试对照品种晋麦47 为试验材料，利用山西农业大学小麦研究所诱变育种课题组小麦EMS 高效诱变技术进行种子诱变处理，对包含12 272 个单株的M2突变体库表型性状进行了调查统计，旨在创制特殊的突变材料，为小麦遗传研究提供资源。此外，针对晋麦47 株高偏高、品质较差的缺陷，在M7和M8高代诱变材料中筛选出株高较野生型降低且农艺性状接近野生型的50 份突变材料，利用近红外分析仪进行品质性状快速测定，初步筛选出品质性状优于野生型的突变材料，以期为小麦抗旱品种品质改良与新品种选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

晋麦47，由山西省农业科学院棉花研究所旱地小麦育种组育成，1995年通过山西省品种审定委员会审定，1998年又分别通过国家及陕西省品种审定委员会的审定，至今仍被作为国家和山西省旱地区试的对照品种。

1.2 试验方法

1.2.1 诱变处理 首先，挑选籽粒均匀一致的晋麦47 纯系种子，用0.1%HgCl2处理15 s，灭菌超纯水漂洗种子3 次，再用灭菌超纯水在20℃条件下浸泡8 h，中间每隔2 h 取出用灭菌超纯水清洗1 次；其次，将浸泡后的种子平铺于湿润滤纸上，每隔2 h 加入灭菌超纯水保持滤纸湿润，待种子萌发直至露白；然后，用灭菌超纯水清洗3 次，将种子放置于阴凉处晾干；最后，将阴干的种子浸泡于0.6%EMS 磷酸缓冲液中，20℃条件下30 r·min－1震荡6 h。处理完成后加入5%Na2S2O3溶液终止反应，用灭菌超纯水清洗3 次，清洗过的种子放置于阴凉处晾干。

1.2.2 田间种植与表型性状的调查 试验在山西农业大学小麦研究所韩村试验基地进行，全生育期无灌溉。2017年9月25日将EMS 处理后的M1种子进行点播，行距0.25 m，株距0.08 m，成熟后每株选取主茎单穗收获M2种子。2018年9月28日将M2种子每行30 粒点播种植成穗行，行距、株距同上年度，每20 行插入晋麦47 野生型作为对照。2019年在小麦灌浆中后期调查M2每个穗行的株数，观察并记载株高、株型、育性、穗型、叶型、分蘖、芒、抗病性等表型性状的突变株数。

M7和M8突变材料共计663 份，是由山西农业大学小麦研究所诱变育种课题组自2010年起利用EMS诱变处理晋麦47 种子，并从诱变后代中筛选获得的农艺性状较好的且能稳定遗传的突变后代。2018年9月28日将M7和M8种子进行双行区点播，每行40粒，行长2 m，行距0.20 m，株距0.05 m。2019年6月成熟后按材料进行收获，脱粒后用于品质性状测定。

1.2.3 籽粒品质性状的测定 从M7和M8诱变材料中筛选出50 份遗传稳定、株高低于野生型、综合农艺性状较好的突变体，利用DA7200 多功能近红外分析仪(瑞典波通公司)测定其与野生型籽粒的硬度指数、蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、吸水率、稳定时间、最大拉伸阻力和拉伸面积共8 个品质指标，重复3 次。

1.3 数据分析

利用Microsoft Office Excel 2007 和SPSS 19.0 软件进行数据的整理和分析。

2 结果与分析

2.1 M2 表型性状的突变类型与突变率

对M2群体的12 272 个单株表型性状进行调查，发现3 711 个突变单株，主要包括茎秆性状突变、育性突变、穗型突变、抗病性突变、叶性状突变、生育期突变、芒性状突变和其他一些突变，总突变率为30.24%(表1)，突变类型丰富。其中，育性、株高和穗型的突变体数量最多，分别为923 株、768 株和742 株，其突变率分别为7.52%、6.26%和6.05%。部分表型突变体如图1所示。

表1 M2 群体的突变类型及突变率Table 1 Mutation type and mutation rate of M2 population

2.1.1 茎秆性状突变 晋麦47 野生型在本试验田内株型紧凑，株高74 cm 左右，6～10 个分蘖。M2群体中观察到1 293 株茎秆性状突变体，突变率为10.54%，包括株高突变(768 株)、分蘖突变(494 株)和株型突变(31 株)3 种类型，突变率分别为6.26%、4.03%和0.25%。

株高突变中，一类表现为矮秆突变(图1－A－1、2、3、4、8)，突变体株高变异范围为9～64 cm，共595 株，突变率为4.85%。其中，图1－A－1、2、4 类型的矮杆突变体有效分蘖数较野生型减少；图1－A－3 类型的矮杆突变体有效分蘖数较野生型增加；图1－A－8 类型的矮杆突变体为极矮株，株高约9～12 cm，表现为丛生，分蘖较多，但植株节间不伸长，穗被包裹在叶鞘内，结实率低。另一类表现为高秆突变(图1－A－6、7)，突变体株高约81～99 cm，共173 株，突变率为1.41%。

分蘖突变中，包含单蘖突变体(图1－B－1)172 株，表现为单株仅有主茎，无分蘖，突变率为1.40%；寡蘖突变体(图1－B－2、3)321 株，表现为单株分蘖仅2～3个，突变率为2.62%；多蘖突变体(图1－B－4)1 株，单株分蘖多达19 个，突变率为0.01%。

株型突变中，一种突变体株型表现为半紧凑(图1－C－1)，共17 株，突变率为0.14%；一种突变体株型表现为松散(图1－C－2)，共14 株，突变率为0.11%。

2.1.2 育性突变 M2群体中观察到923 株不育突变体，表现为雄性不育，花药瘦小干瘪，花粉不育，突变率为7.52%。其中424 株突变体表现为完全不育(图1－D－1、2、3、4)，穗型瘦弱单薄，突变率为3.46%；499 株突变体部分不育，表现为上部与下部小穗不育(图1－D－5、6)，突变率为4.07%。

2.1.3 穗型突变 晋麦47 野生型为长方形穗，平均穗长7～9 cm。M2群体中观察到穗型突变体742 株，突变率为6.05%。主要有6 种突变类型:大方穗突变(图1－E－8、9、11)，突变体穗长约10～12 cm，长方形穗，穗码较密，共122 株，突变率为0.99%。拟斯卑尔脱小麦穗型突变(图1－E－7)，突变体与斯卑尔脱小麦穗型相似，穗长约9.5～10.5 cm，穗码稀，颖壳较硬，外颖有芒，成熟后穗轴易断，共107 株，突变率为0.87%。尖穗突变(图1－E－10)，突变体穗细长呈锥形，约9～12 cm，穗码较稀，共303 株，突变率为2.47%。短穗突变，共196 株，突变率为1.60%。其中，一类突变体穗型与对照相似，但穗长变短，约5～6 cm(图1－E－3、4)；另一类表现为极短穗(图1－E－1、2)，形似纺锤，穗长约3～5 cm，结实粒少。密穗突变(图1－E－6)，突变体穗长约7～8 cm，穗上部小穗着生紧密，呈大头状，穗下部表现正常，共8 株，突变率为0.07%。卷穗突变(图1－E－5)，突变体籽粒饱满，穗轴中部发生侧弯，芒弯曲不直挺，共6 株，突变率为0.05%。

图1 M2 群体部分突变体Fig.1 Partial mutants of M2 population

2.1.4 抗病性突变 晋麦47 野生型表现为感白粉病，中感条锈、叶锈M2群体中观察到267 株抗病性与野生型发生变化的突变株，突变率为2.18%。主要包括3 种类型的抗病性突变:白粉病抗性突变，27 株中感白粉病(图1－F－1)、1 株中抗白粉病(图1－F－2)和226 株高感白粉病(图1－F－3)，突变率分别为0.22%、0.01%和1.84%。锈病抗性突变，共发现2 株突变体高感条锈，10 株高感叶锈，突变率分别为0.02%、0.08%。颖枯病抗性突变，发现1 株突变体小穗上部的颖壳有深褐色斑点，感染颖枯病，突变率为0.01%。

2.1.5 叶性状突变 晋麦47 野生型叶片上举，颜色深绿。M2群体中观察到叶片性状突变体224 株，突变率为1.83%。其中，84 株窄叶突变(图1－G－1)，旗叶较对照变窄三分之一左右，叶片上举，植株透光性好，突变率为0.68%；33 株卷叶突变(图1－G－2)，旗叶靠近茎秆部位表现为褶皱，叶片中部扭转，突变率为0.27%；107 株宽叶突变(图1－G－3)，旗叶较对照宽0.5 cm 左右，叶片变厚，上举，突变率为0.87%。

2.1.6 生育期突变 晋麦47 野生型后期灌浆快，叶片鲜绿，穗呈黄绿色。M2群体中观察到116 株生育期突变体，突变率为0.95%。主要包括:晚熟突变体(图1－H－1)，多为矮化突变株，叶片持绿性强，但籽粒灌浆速度慢，成熟期推迟3～5 d，共98 株，突变率为0.8%。早熟突变体(图1－H－2)，植株在灌浆后期迅速失绿，籽粒脱水速度变快，生育期提前2～3 d，共18株，突变率为0.15%。

2.1.7 芒性状突变 晋麦47 野生型表现为长芒，芒色浅白。M2群体中观察到27 株芒性状突变体，突变率为0.22%。包含无芒突变体、黄芒突变体(图1－I－1)与褐芒突变体(图1－I－2)各9 株，突变率均为0.07%。

2.1.8 其他类型的突变 此外，还观察到叶黄化突变、叶黄斑突变与表皮蜡质突变。有10 株突变体仅叶尖部黄化，影响光合作用，突变率为0.08%(图1－J－1)；有11 株突变体整株叶片全部黄化，籽粒灌浆受阻，突变率为0.09%(图1－J－2、3)。叶黄斑突变(图1－J－4)共9 株，突变体叶片上密布着细小的黄色斑点，斑点内部逐渐失绿干枯，而后扩大致整个叶片干枯，突变率为0.07%。表皮蜡质突变体(图1－K－1、2)，与野生型相比，突变体旗叶叶鞘表面覆盖着一层较厚的白霜状蜡质，旗叶背面也有少量分布，植株颜色呈灰绿色，共89 株，突变率为0.73%。

2.2 高代突变材料籽粒性状的变异

2.2.1 籽粒形态的变异 晋麦47 野生型籽粒较长，色偏白，呈椭圆型，饱满度较好，腹沟较浅。从50 份M7和M8突变材料主要观察到以下突变:粒形突变，突变体籽粒形状较野生型呈现为方形(图2－A－1)、卵圆形(图2－A－2)和锥形(图2－A－3)；粒长突变，一些突变体籽粒长度较野生型变短(图2－B－1、2)，一些较野生型变长(图2－B－3、4、5)；饱满度突变，与野生型相比，一种突变体籽粒腹沟变深(图2－C－1)，一种籽粒饱满度降低，籽粒较瘪(图2－C－2)，另一种籽粒饱满度增加，籽粒圆润(图2－C－3)；粒色突变，与野生型相比，部分突变体粒色偏白(图2－D－1)，部分突变体粒色偏红(图2－D－2)。

2.2.2 品质性状的变异 8 个品质性状可以被分为籽粒品质(硬度指数、蛋白质含量)和小麦粉品质(湿面筋含量、沉降值、吸水率、稳定时间、最大拉伸阻力、拉伸面积)两类指标[21]。由表2可知，50 份M7和M8突变材料的两类指标均较野生型发生了不同程度的变异，且除吸水率外，其余性状均有一定比例的材料产生了正向变异。其中稳定时间、拉伸面积、最大拉伸阻力和沉降值的变异系数最高，说明这4 个性状在诱变后产生了丰富的变异类型，在突变材料中筛选到目标性状突变体的概率较大。

表2 50 份M7 和M8 突变材料品质性状的变异表现Table 2 Variation of quality characters of fifty M7 and M8 mutants

籽粒品质指标中，50 份M7和M8突变材料的硬度指数和蛋白质含量平均值较野生型分别下降15.88%和4.18%，变异系数分别为11.14%和10.86%。其中，硬度指数发生正向变异的材料仅为2 个，说明从EMS 诱变后代中选择硬度指数高于野生型的概率较低；蛋白质含量发生正向变异的比例为38.00%，说明通过EMS 诱变可有效对晋麦47 的蛋白质含量进行改良。

小麦粉品质指标中，50 份M7和M8突变材料的湿面筋含量、沉降值、吸水率和稳定时间平均值较野生型分别降低3.81%、7.31%、6.82%和17.56%；最大拉伸阻力和拉伸面积的平均值较野生型分别增加5.87%和6.28%。从变异系数来看，各性状表现为稳定时间(37.76%) >拉伸面积(34.31%) >最大拉伸阻力(32.03%)>沉降值(27.56%)>湿面筋含量(9.58%)>吸水率(3.44%)。其中稳定时间的最大值较野生型提高了56.91%，与之类似突变材料中沉降值、最大拉伸阻力、拉伸面积的最大值分别较野生型提高了68.56%、84.85%和111.39%，且发生正向突变的比例分别为28%、28%、36%和40%，说明在诱变后代中可能较易筛选出这4 个性状优于野生型的突变体。

综合考虑上述各项品质指标，在50 份M7和M8突变材料中初步筛选出了4 份材料，其综合品质性状优于野生型，且株高较野生型低，农艺性状较好。

3 讨论

当前，EMS 作为植物诱变育种中最常用、最有效的一种化学诱变剂，能够快速诱发植物基因突变，被广泛地用于构建小麦突变体库[22－23]。王长里[24]利用0.3%EMS 溶液处理小麦河农822 的种子，在21 048株M2诱变群体中观察到3 063 株突变体，突变率为14.6%。；徐艳花等[25]利用0.8%EMS 溶液处理小麦豫农201 的种子，从6 305 个M2诱变群体中获得了722份叶、茎、穗、籽粒等性状变异的突变体，总突变率为9.17%；倪永静等[26]利用0.4% EMS 溶液处理国麦301 的种子，从12 020 个M2穗系中筛选出769 个突变体，突变率为6.398%。本研究利用0.6%EMS 溶液诱变种子构建了晋麦47 的突变体库，从12 272 株M2成苗中观察到3 711 株表型性状突变体，总突变率为30.24%。本研究中，M2突变率明显高于现有报道，这可能与供试品种及EMS 诱变方法的创新有关。本研究基于种子萌发各阶段对EMS 的敏感程度存在较大的差异，尤以幼嫩的分生组织对EMS 诱导最为敏感这一原理[27]，前期对种子进行预处理，使其萌发至露白，利用EMS 溶液处理露白的种子，最终大幅提高了EMS诱变率。

本研究结果表明，从M2中观察到茎秆性状、穗型、叶片性状、芒部性状、生育期、育性和抗病性等方面共32 种突变类型。其中，育性、株高和穗型的突变株数最多，诱变效应最为明显，突变率排序为:育性>株高>穗型。赵天祥等[28]对偃展4110 M2突变体库的研究也证实了育性的突变率最高，这说明控制育性的基因经过EMS 诱变后最易发生突变；陈亮[29]利用0.8%EMS 溶液处理晋麦47 的种子得到M2共2 610 个单株，发现表型变异中株高变异最多，且全部表现为矮秆和半矮秆的突变，而本研究中株高突变虽以矮杆突变体居多，但也存在部分高秆突变，研究结果的差异可能与诱变群体数量及诱变方法的差异有关。

蜡质材料因其表皮覆盖着一层白霜状蜡质，能够控制表皮非气孔性的水分散失和气体交换，与植物的抗旱节水性相关[30－32]，具有抵御多种生物和非生物胁迫的功能[33]。杨彦会等[34]研究了干旱胁迫对不同蜡质含量小麦近等基因系光合性能的影响，发现蜡质含量对提高小麦的抗旱性有积极影响，并且在中度和重度干旱胁迫条件下，多蜡质品系较少蜡质品系的抗旱节水性更加显著。Li 等[35]研究也表明蜡质缺失突变体w5 较野生型济麦22 对干旱条件更为敏感。本研究在干旱胁迫条件下发现了蜡质含量高于野生型的突变体，结合前人研究结论推断在胁迫条件下，蜡质含量高的突变体抗旱性可能会优于野生型；研究还在相同环境条件下发现了极矮化、单蘖、早衰突变体，推测其抗旱性较野生型可能有所减弱。这些特殊突变体的发现不仅丰富了小麦抗旱资源库，也为小麦抗旱分子机理及功能基因的发掘提供了宝贵的研究材料。然而，M2突变材料存在继续分离的现象，对于这些特殊突变性状是否能够稳定遗传，需要待M3至M5遗传稳定后进行进一步验证。如果能够稳定遗传，可以将野生型作为轮回亲本与优良突变体进行连续回交达到性状改良的目的，在后代中筛选出具有目标性状且综合农艺性状优良、遗传稳定的单株，直接作为抗旱小麦新品系加以利用。

随着小麦单产水平的逐步提高，品质改良已成为当前育种工作的焦点之一。利用EMS 对小麦种子进行诱变处理，从诱变后代中筛选品质较好的突变材料，可以有效打破基因连锁，为小麦品质育种提供新的资源，从而提高优质小麦新品种选育效率[14]。薛芳等[36]利用EMS 诱变处理新春11 小麦种子，发现0.7%EMS 处理下高抗性淀粉含量的突变体更为丰富，并筛选出7 个抗性淀粉含量高且综合性状优良的M2突变材料；徐艳花等[25]使用0.8%EMS 诱变豫农201种子，从930 个株系中筛选出21 个HMW-GS 缺失突变株系；于利伟等[37]对小麦优质品种西昌69 进行EMS 诱变，使用近红外谷物分析仪对1 667 个M6材料进行品质性状测定，筛选出28 个籽粒品质性状优于诱变亲本的突变材料，并认为借助近红外谷物分析仪从大量诱变后代中进行初步筛选，可有效提高小麦优质品种选育效率。本研究为快速筛选出农艺性状较好且品质性状优于野生型晋麦47 的突变材料，从663 份M7和M8突变体中筛选出株高低于野生型的50 份材料，利用近红外谷物分析仪进行品质性状分析，发现稳定时间、拉伸面积、最大拉伸阻力、沉降值和形成时间的变异系数较高，且发生正向突变的比例也相对较高，说明EMS 诱变对小麦品质性状的影响较大，在诱变后产生了丰富的变异类型，为小麦品质性状的改良提供了较大的选择空间。其中，稳定时间的变异系数最大，与于利伟等[37]对小麦M6品质性状的测定结果一致，这是由于稳定时间受多个基因位点调控[38]，经过EMS诱变后发生突变的位点相对于其他性状较多。此外，本研究初步筛出4 个综合品质性状均优于野生型且农艺性状较好、株高较低的突变体，下一步计划将其种植于不同环境中，利用国家标准对其品质性状进行验证，以确认其品质性状的突变能够稳定遗传。

4 结论

本研究利用改进的EMS 诱变技术构建了旱地小麦晋麦47 M2表型突变体库，观察到了茎秆性状、穗型、叶片性状、芒部性状、生育期、育性和抗病性等32种突变类型，总突变率达30.24%，为小麦抗旱分子机理及功能基因的发掘提供了丰富的遗传材料。其中大穗、矮杆、多蘖、蜡质、大粒和籽粒饱满的优良突变体，为旱地小麦的遗传改良奠定了材料基础。此外，50 份M7和M8诱变材料籽粒的形态和品质均发生了不同程度的变异，并初步筛选出了4 份农艺性状优良且综合品质性状优于野生型的突变体材料。